體外皮膚變態(tài)反應(yīng) U937細(xì)胞激活試驗(yàn)方法

附件6體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗(yàn)方法U937CellLineActivationTest1范圍本方法規(guī)定了體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料潛在致敏性的評價。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)用于檢測體外培養(yǎng)的人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)變化，以評價受試物引起皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性。3定義3.170%細(xì)胞存活率濃度值70%cellviability（CV70）受試物染毒后，細(xì)胞存活率為70%時對應(yīng)的受試物濃度值。3.2刺激指數(shù)stimulationindex（S.I.）與溶劑對照相比，扣除同型對照后流式細(xì)胞儀測定的受試物陽性細(xì)胞相對強(qiáng)度值。3.3CD86有效作用濃度值EffectiveConcentration150（EC150）CD86的相對熒光強(qiáng)度值達(dá)到150時對應(yīng)的受試物濃度值。4試驗(yàn)的基本原則當(dāng)致敏物質(zhì)接觸皮膚后，樹突狀細(xì)胞在移動到淋巴器官的過程中分化成熟，并上調(diào)一系列表面分子的表達(dá)。體外培養(yǎng)類樹突狀細(xì)胞：人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，并和受試物共暴露48h后，使用熒光抗體染料對細(xì)胞表面分子CD86染色并用流式細(xì)胞儀測定，從而評價受試物是否具有致敏性。5試劑5.1細(xì)胞選用人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞（Thehumanhistiocyticlymphomacellline，U937細(xì)胞）。細(xì)胞使用前應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。推薦使用cloneCRL1593.2細(xì)胞株。5.2培養(yǎng)基RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、適量抗生素，配制成1640完全培養(yǎng)基。5.3染色緩沖液磷酸鹽緩沖液中加入5%的胎牛血清。5.4染料和抗體類物質(zhì)7-氨基放線素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidiumiodide,PI）FITC標(biāo)記的小鼠單克隆CD86抗體（FITC-CD86）FITC標(biāo)記的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6試驗(yàn)方法6.1細(xì)胞準(zhǔn)備6.1.1細(xì)胞培養(yǎng)U937懸浮細(xì)胞使用1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞復(fù)蘇一周并通過穩(wěn)定性檢測后可開展試驗(yàn)。細(xì)胞最大培養(yǎng)濃度不超過2×106個/mL，復(fù)蘇后使用不超過6周，傳代次數(shù)不超過21代。6.1.2細(xì)胞穩(wěn)定性檢測細(xì)胞復(fù)蘇兩周后，選用松香酸（AA）或2,4,6-三硝基苯磺酸作為陽性對照，乳酸（LA）作為陰性對照。當(dāng)細(xì)胞可以準(zhǔn)確對陽性物質(zhì)和陰性物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定區(qū)分時視為通過穩(wěn)定性檢測。6.2受試物處理溶劑：完全培養(yǎng)基（優(yōu)先選擇）或二甲基亞砜（DMSO）受試物儲備液：第一次運(yùn)行至少選擇6個濃度。于試驗(yàn)前一天制備，應(yīng)用1640完全培養(yǎng)基配制0.4mg/mL的受試物溶液，或者應(yīng)用DMSO配制50mg/mL的受試物溶液。由于沒有進(jìn)行劑量測定，因此在第一次運(yùn)行時，應(yīng)在相應(yīng)的溶劑中配制6種系列濃度儲備液（最終濃度為1、10、20、50、100和200μg/mL）。受試物工作液：于試驗(yàn)當(dāng)天制備，用完全培養(yǎng)基配制的受試物溶液可以直接使用，用DMSO配制的受試物溶液需用完全培養(yǎng)基稀釋125倍得到工作溶液。將工作液等體積加入細(xì)胞懸液中進(jìn)行染毒，即最終細(xì)胞接觸濃度是工作液濃度再稀釋2倍。連續(xù)運(yùn)行的濃度選擇：基于第一次運(yùn)行的結(jié)果選擇至少4個第二次運(yùn)行的濃度，任何后續(xù)運(yùn)行的濃度都是基于之前所有運(yùn)行的單個結(jié)果來選擇。由于濃度間隔設(shè)置較小會影響濃度效應(yīng)，所以建議以下推薦使用的最終濃度(單位：μg/mL)進(jìn)行試驗(yàn)：1、2、3、4、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200。如果以上濃度無法測得受試物的70%細(xì)胞存活率濃度值（70%cellviability，CV70），可以進(jìn)行濃度調(diào)整。但受試物最終細(xì)胞接觸濃度最高不超過200μg/mL；如果CD86的陽性值在1μg/mL，則對0.1μg/mL進(jìn)行評估，以確認(rèn)不會導(dǎo)致CD86超過陽性閾值的受試物的濃度；DMSO最終接觸濃度不得超過0.4%。選擇標(biāo)準(zhǔn)：至少2個濃度與前一次試驗(yàn)相同；確認(rèn)非細(xì)胞毒性下的最高CD86陰性濃度;確認(rèn)所有非細(xì)胞毒性CD86陽性濃度；確認(rèn)最低細(xì)胞毒性濃度；在EC150(或最高陰性非細(xì)胞毒性濃度)和CV70（或溶解度評估允許的最高濃度）之間均勻選擇其他所需濃度；若前兩次運(yùn)行有差異，盡可能選擇多的共同濃度；若存在干擾，需重新選擇陽性濃度。6.3對照物處理培養(yǎng)基對照、溶劑對照（與受試物同法稀釋）、陽性對照松香酸（DMSO溶解，最終濃度50μg/mL）、陰性對照LA（完全培養(yǎng)基溶解，最終濃度200μg/mL），每種對照需要準(zhǔn)備三對復(fù)孔。6.4細(xì)胞鋪板及染毒以3x105個/mL細(xì)胞傳代培養(yǎng)2天或以1.5x105個/mL傳代培養(yǎng)3天后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，取100μL/孔受試物工作液和100μL/孔細(xì)胞懸液1:1混合接種于96孔無菌平板中，每種條件下一對復(fù)孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgG1同型對照染色。每次CD86表達(dá)檢測均需設(shè)置培養(yǎng)基對照、溶劑對照、陽性對照、陰性對照各三對復(fù)孔（當(dāng)使用培養(yǎng)基作為溶劑時，溶劑對照與培養(yǎng)基相同），用密封帶蓋住板，在37±2°C，5±1%CO2，≥95%濕度下培養(yǎng)孵育45h±3h。6.5CD86表達(dá)檢測孵育結(jié)束后，檢查并確定溶解度（若在顯微鏡下觀察到晶體或液滴，則會產(chǎn)生干擾）。用排槍將細(xì)胞吹兩下從96孔平板對應(yīng)移至V型板中，離心棄上清；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重懸細(xì)胞；用7-AAD染色細(xì)胞（5μL/孔，10min室溫，避光）；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重新懸浮細(xì)胞；用FITC標(biāo)記的抗CD86或小鼠IgG1（5μL/孔，30min，4°C，避光）染色細(xì)胞；用100μL冰冷染色緩沖液清洗兩次；用100μL冰冷PBS清洗一次；在冰冷PBS中再懸浮細(xì)胞（96孔板中100μL或流式管中200μL）。注意：整個染色操作應(yīng)在冰上進(jìn)行，在每一個洗滌步驟中，不要通過反復(fù)的移液來重懸細(xì)胞，而是在棄去上清液后通過短暫的渦旋來分散細(xì)胞即可。用流式細(xì)胞儀對每組細(xì)胞的細(xì)胞存活率及CD86陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行測定。分別用以下用公式計算出受試物的細(xì)胞存活率（CV70）和受試物的細(xì)胞刺激指數(shù)（S.I.）。CV70=C1+V1：大于70%最小細(xì)胞活性值V2：小于70%最大細(xì)胞活性值C1（μg/mL）：V1對應(yīng)的受試物濃度C2（μg/mL）：V2對應(yīng)的受試物濃度S.I.=CD86+%：CD86陽性細(xì)胞百分比6.6流式細(xì)胞儀檢測繪制SSC/FSC散點(diǎn)圖，調(diào)節(jié)儀器電壓，圈出U937細(xì)胞群P1門；繪制7-AAD直方圖，圈出活細(xì)胞P2門；繪制FITC/SSC散點(diǎn)圖，放置十字門，分析細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)。通過獲取完全培養(yǎng)基/IgG1孔表達(dá)值，設(shè)置FITC/SSC十字門分析標(biāo)記，以便在可能的情況下，所有三個或至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1位于0.6至0.9%區(qū)域內(nèi)；如果這無法實(shí)現(xiàn)，則設(shè)置分析標(biāo)記，使一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.6至0.9%，另一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.9%至1.5%；如果這仍然無法實(shí)現(xiàn)，則IgG1數(shù)據(jù)分布太廣，必須放棄運(yùn)行。之后在不移動分析標(biāo)記的情況下，測量每個孔中IgG1陽性細(xì)胞或CD86陽性細(xì)胞的百分比。細(xì)胞顯示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散點(diǎn)圖中，設(shè)置為對數(shù)比例（Log），以便清楚地識別第一門R1門中的（population）細(xì)胞群和消除碎片。設(shè)置流式細(xì)胞儀，每孔獲得P1門細(xì)胞10000個或包括死亡細(xì)胞在內(nèi)的多達(dá)20,000個細(xì)胞，或在分析開始后1min內(nèi)獲取數(shù)據(jù)。7結(jié)果評價7.1試驗(yàn)成立條件7.1.1完全培養(yǎng)基對照細(xì)胞平均存活率>90%；至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1≥0.6且<1.5%；若丟棄一個完全培養(yǎng)基對照的離群值后，剩下的兩個完全培養(yǎng)基對照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；完全培養(yǎng)基對照校正后的CD86基礎(chǔ)表達(dá)值≥2%且≤25%。7.1.2DMSO溶劑對照的平均存活率>90%；若丟棄一個DMSO對照的異常值后，剩下的兩個DMSO對照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；丟棄異常值后，DMSO溶劑對照CD86S.I.的平均值小于250%。7.1.3陽性對照三對復(fù)孔中至少兩個為陽性（CD86S.I.≥150），必要時配制陽性對照系列濃度，應(yīng)存在劑量反應(yīng)。7.1.4陰性對照三對復(fù)孔中至少有兩個為陰性（CD86S.I.<150%），且細(xì)胞活性≥70%。7.1.5溶解度干擾：受試物處理后45±3h(細(xì)胞染色前)在顯微鏡下觀察到晶體或滴狀，則提示測試受到受試物溶解度干擾。7.1.6顏色干擾：受試物FITC標(biāo)記IgG1散點(diǎn)圖如發(fā)生位置偏移，則提示測試受到受試物顏色干擾（IgG1熒光通道幾何平均數(shù)S.I.≥150%）。7.2致敏性結(jié)果判定每種受試物至少進(jìn)行兩次獨(dú)立的CD86表達(dá)檢測試驗(yàn)。每種受試物表達(dá)檢測試驗(yàn)，如果CD86S.I.僅在最高非細(xì)胞毒性濃度下高于150%，則在第一次試驗(yàn)中無法判定。每次表達(dá)檢測試驗(yàn)，如果CD86S.I.在所有非細(xì)胞毒性濃度下低于150%，且無干擾（溶解度、顏色、細(xì)胞毒性），則該次CD86表達(dá)判定為陰性；如果CD86S.I.高于150%，不論有無劑量反應(yīng)和/或干擾，則該次CD86表達(dá)均判定為陽性。如果兩次試驗(yàn)CD86表達(dá)結(jié)果一致，則可判定該受試物是否具有致敏性；如果兩次試驗(yàn)CD86表達(dá)不具有一致性，則需進(jìn)行第三次試驗(yàn)。如果第一次試驗(yàn)無法判定，第二次與第三次結(jié)果不一致，則需進(jìn)行第四次試驗(yàn)。最終的預(yù)測將基于三次或四次單獨(dú)運(yùn)行的結(jié)果來綜合判定。7.3有效作用濃度計算對于判定具有致敏性的物質(zhì)，進(jìn)一步計算其有效作用濃度值（EffectiveConcentratio