細菌感染的實驗診療培訓課件

細菌感染的實驗診療感染的診斷有賴于從標本中檢出病原體或檢出病原體的可溶性抗原,或病原體的DNA病人血清中檢出病原體的抗體本章主要討論檢出病原體的問題2細菌感染的實驗診療第一節(jié)實驗診斷的目的與要求3細菌感染的實驗診療進行病原學診斷進行藥敏試驗,指導合理用藥用作流行病學調(diào)查,追蹤傳染源研究病原生物與感染的關(guān)系一.目的4細菌感染的實驗診療

鮑氏痢疾志賀菌13型暴發(fā)

時間：1992年9月發(fā)?。?6名死亡：10名地點：某嬰兒室傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦傳播方式：通過污染操作臺接觸5細菌感染的實驗診療鼠傷寒暴發(fā)

時間：1991年11月地點：某嬰兒室發(fā)?。?5名死亡：23名56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件檢出鼠傷寒沙門菌6細菌感染的實驗診療二.診斷試驗的選擇有價值的快速簡便的特異性和敏感性高的7細菌感染的實驗診療可用的方法:查病原體:直接涂片分離,對純培養(yǎng)物進行鑒定查可溶性抗原:用已知抗體查DNA:分子生物學方法查抗體:用已知抗原IgMIgG:效價有4倍以上增高8細菌感染的實驗診療三.細菌鑒定流程

雙歧檢索:以某一試驗分表解:用多種試驗整體分析數(shù)字編碼:將多種試驗分別編碼,數(shù)字化后查表9細菌感染的實驗診療革蘭氏陰性桿菌葡萄糖發(fā)酵+-氧化酶+-弧菌腸桿菌非發(fā)酵菌10細菌感染的實驗診療ABCDE甲乙丙丁++--++++----++--+-++11細菌感染的實驗診療組別試驗代碼結(jié)果結(jié)果代碼總值1A4-01B2-0C1+1

2D4+45E2-0F1+1

15…12細菌感染的實驗診療微量生化反應(yīng)系統(tǒng)和自動化

各試驗孔含不同試驗的脫水底物

加入純化的被檢菌

孵育4-24h觀察結(jié)果人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或電腦讀取13細菌感染的實驗診療第二節(jié)臨床標本的采集與處理14細菌感染的實驗診療一.標本采集的原則早期,用抗菌藥物前根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標本無菌技術(shù),避免正常菌群污染,防止病原體播散采用合適的方法15細菌感染的實驗診療二.標本的處理盡快接種到合適的培養(yǎng)基上根據(jù)抵抗力選擇保存和運輸條件厭氧菌奈瑟菌病毒16細菌感染的實驗診療第三節(jié)細菌的形態(tài)學檢查17細菌感染的實驗診療一.不染色標本用懸滴法或壓片細菌是活的,可觀察運動加入特異抗體可抑制其運動結(jié)合標本來源可作初步診斷,如霍亂,梅毒用相差或暗視野顯微鏡效果更好18細菌感染的實驗診療壓片懸滴法19細菌感染的實驗診療二.染色標本革蘭染色(Gramstain):紫色革蘭陽性;紅色革蘭陰性.注意細菌的大小,形狀,排列以及著色的均一性抗酸染色(acid-faststain):紅色抗酸陽性,藍色抗酸陰性熒光染色:更易觀察20細菌感染的實驗診療特殊染色可用于觀察莢膜,鞭毛等細菌的特殊結(jié)構(gòu)21細菌感染的實驗診療第四節(jié)細菌的分離培養(yǎng)22細菌感染的實驗診療一.細菌生長的要求培養(yǎng)基:營養(yǎng)物質(zhì),pH7.4氣體:需氧菌,厭氧菌,兼性厭氧菌,微需氧菌溫度:一般37°C時間:一般18~24h23細菌感染的實驗診療二.培養(yǎng)基1.對培養(yǎng)基的基本要求足夠的營養(yǎng)物質(zhì)合適的pH無菌澄清24細菌感染的實驗診療2.培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基成分分:基礎(chǔ)培養(yǎng)基:滿足一般細菌要求營養(yǎng)培養(yǎng)基:滿足苛求細菌要求鑒別培養(yǎng)基:加有被利用物和指示劑選擇培養(yǎng)基:加有抑制劑,能抑制非目的菌生長特殊培養(yǎng)基:滿足特殊細菌要求25細菌感染的實驗診療按培養(yǎng)基物理性狀分:液體:增菌固體:加2%瓊脂,平板用于分離純種,斜面用于傳代或保存細菌半固體:加0.5%瓊脂,用于觀察動力,保存菌種26細菌感染的實驗診療三.主要的接種方法分區(qū)劃線法:用于分離純種,多次燒灼減少菌數(shù),以獲取單個菌落連續(xù)劃線:不要求單個菌落,用于保存或繁殖細菌涂布:使細菌長成菌苔,可觀察細菌被抑制情況或用于繁殖細菌傾注平板:少量細菌混于瓊脂中倒板,計數(shù),分離純種27細菌感染的實驗診療四.細菌生長的表現(xiàn)固體基:菌落形成,注意其

大小,形狀表面,邊緣質(zhì)地,透明度溶血情況液體基:渾濁,菌膜,沉淀28細菌感染的實驗診療五.純種的獲得純種是細菌學工作的基礎(chǔ)獲得方法:劃線分離法(傾注平板法)獲得大的單個菌落斜面純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)應(yīng)是一致的29細菌感染的實驗診療30細菌感染的實驗診療31細菌感染的實驗診療六.培養(yǎng)細菌的目的確定有無細菌鑒定細菌藥敏試驗計數(shù)細菌利用細菌:制備菌苗,生產(chǎn)抗生素或基因工程產(chǎn)品32細菌感染的實驗診療第五節(jié)細菌代謝產(chǎn)物的檢測33細菌感染的實驗診療一.細菌毒素的檢測內(nèi)毒素:致熱作用:兔體溫鱟試驗外毒素:體內(nèi):毒素與抗毒素的中和試驗體外:Elek平板法:沉淀反應(yīng)ELISA34細菌感染的實驗診療毒素和抗毒素的中和試驗外毒素?外毒素?+已知抗體小白鼠小白鼠結(jié)果發(fā)病發(fā)病有毒性,但不是相應(yīng)的發(fā)病不發(fā)病是相應(yīng)毒素不發(fā)病不發(fā)病無毒性35細菌感染的實驗診療抗毒素待測細菌沉淀線Elek試驗36細菌感染的實驗診療二.生化反應(yīng)欲檢測細菌的生化反應(yīng),一般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測物和檢測其代謝產(chǎn)物的試劑,即在鑒別培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),或直接加試劑于培養(yǎng)物中,觀察呈色等現(xiàn)象判定結(jié)果

37細菌感染的實驗診療(一)碳水化合物的代謝試驗糖(醇)發(fā)酵試驗:酸,氣體氧化-發(fā)酵(O/F)試驗:?-半乳糖苷酶(ONPG)試驗七葉苷水解試驗甲基紅試驗V-P試驗38細菌感染的實驗診療(二)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗

明膠液化試驗Indol試驗Ura試驗H2S試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗氨基酸脫羧酶試驗39細菌感染的實驗診療(三)碳源氮源利用枸櫞酸鹽利用試驗丙二酸鹽利用試驗40細菌感染的實驗診療枸櫞酸鹽利用試驗41細菌感染的實驗診療(四)酶氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗卵磷脂酶試驗?zāi)堂冈囼濩AMP試驗?zāi)懼芫囼?2細菌感染的實驗診療(五)抑菌試驗O/129試驗桿菌肽試驗Optochin試驗43細菌感染的實驗診療一.血清學鑒定了解微生物的抗原結(jié)構(gòu)用已知抗體檢測細菌的抗原組合特異性較高多在鑒定的最后進行可用多種血清學方法,細菌多用凝集反應(yīng),病毒多用中和試驗45細菌感染的實驗診療二.血清學診斷查抗體:用已知抗原IgM:感染的指標IgG:效價有4倍以上增高或高于當?shù)厝巳核蕉嘤糜诓〕梯^長的全身性感染46細菌感染的實驗診療第七節(jié)感染的分子生物學檢測檢出病原體DNA證明病原體存在47細菌感染的實驗診療一.核酸檢測的用途細菌分類臨床診斷,快速鑒定耐藥性檢測毒素檢測流行病學調(diào)查48細菌感染的實驗診療二.核酸檢測的方法

G+Cmol%PCR限制性內(nèi)切酶片段長度核酸雜交49細菌感染的實驗診療限制性內(nèi)切酶酶切分析

限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切開DNA的酶同樣的內(nèi)切酶可將相同的DNA切成同樣數(shù)目的，同樣大小分子量的片段電泳后對所得圖譜進行分析可判斷DNA是否相同50細菌感染的實驗診療1989年國外某醫(yī)院泌尿科3周內(nèi)從病人血，尿中分出8株不動桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng)SmalI酶切后出現(xiàn)相同片段，但與環(huán)境中或其他科室分出的不動桿菌不同，表明泌尿科的病人是由同一克隆引起的爆發(fā)51細菌感染的實驗診療某醫(yī)院ICU病房，從水池和病人標本中分出多株銅綠假單胞菌，將其染色體DNA用XBal酶切，發(fā)現(xiàn)彼此之間沒有共同的酶切片段圖譜，病人之間圖譜的也不相同，說明這不是一次爆發(fā)52細菌感染的實驗診療第八節(jié)動物實驗53細菌感染的實驗診療一.動物實驗的用途分離細菌,獲取純種檢測其致病性,觀察發(fā)病或死亡,可同時加抗體進行中和試驗或保護試驗制備抗體誘導變異建立感染模型檢測生物制品的安全性

54細菌感染的實驗診療二.實驗動物的選擇多用易感的小動物,如小白鼠,豚鼠按需要選擇純系,突變系,雜種無菌動物(GF),悉生動物(GB),無特殊病原體動物(SPF),最低限度疾病動物(MDA),普通動物可選用多種途徑注射,如腹腔,靜脈,皮下,顱內(nèi)等55細菌感染的實驗診療可供細菌鑒定的方法形態(tài):個體,菌落,液體基生長情況生長需要:氧,溫度,營養(yǎng)物生化反應(yīng):觀察其酶活性抗原性:用已