p53基因克隆表達(dá)及其活性測(cè)定的綜述報(bào)告

p53基因克隆表達(dá)及其活性測(cè)定的綜述報(bào)告概述p53基因是人體中最為重要的腫瘤抑制基因之一，其主要作用是監(jiān)視細(xì)胞DNA損傷并協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)或?qū)е录?xì)胞凋亡。p53基因的突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此p53基因的克隆和表達(dá)及其活性測(cè)定具有非常重要的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本文將對(duì)p53基因克隆表達(dá)及其活性測(cè)定方面的內(nèi)容進(jìn)行綜述，并闡述其在研究和診斷腫瘤等方面的應(yīng)用。p53基因的克隆與表達(dá)p53基因是一個(gè)非常長(zhǎng)的基因，包括了11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，其編碼一個(gè)分子量為53kDa的蛋白質(zhì)。國(guó)外學(xué)者劉家駿等通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)，從人類(lèi)DNA中首次成功克隆了p53基因。目前在臨床上應(yīng)用較為廣泛的p53基因重組表達(dá)載體是pCMV-p53，該載體是以真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV為基礎(chǔ)，將人p53基因全長(zhǎng)克隆插入pCMV的多克隆位點(diǎn)MCS中，構(gòu)建而成?；谀壳皃53基因的克隆和表達(dá)技術(shù)，可以通過(guò)以下步驟來(lái)進(jìn)行p53基因的克隆和表達(dá)：（1）選擇p53基因的模板DNA，例如人外周血或小腸上皮細(xì)胞中的基因組DNA，質(zhì)粒DNA等；（2）設(shè)計(jì)引物并PCR擴(kuò)增p53基因；（3）純化PCR產(chǎn)物，克隆p53基因至pCMV載體中；（4）測(cè)定克隆體的長(zhǎng)度和正確性，并鑒定是否含有p53基因；（5）將pCMV-p53轉(zhuǎn)染進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞中，表達(dá)蛋白質(zhì)。p53基因的活性測(cè)定p53基因蛋白質(zhì)的功能主要由其轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制兩種方式實(shí)現(xiàn)，p53蛋白質(zhì)對(duì)上述兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程的影響，主要是通過(guò)與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行物理互作實(shí)現(xiàn)的。因此，傳統(tǒng)的西方印跡和免疫印跡等方法可以用于p53蛋白質(zhì)的檢測(cè)。另外，細(xì)胞系培養(yǎng)的方法被廣泛應(yīng)用于p53技術(shù)研究中。例如，通過(guò)向黑色素瘤細(xì)胞株ATCCHTB-71中轉(zhuǎn)染p53基因，可以使該細(xì)胞株重新恢復(fù)對(duì)DNA損害或應(yīng)用化學(xué)藥物的敏感性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)p53基因活性的研究。在p53基因活性測(cè)定中，還有一種比較重要的技術(shù)是熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（LuciferaseReporterAssay）。該技術(shù)可以通過(guò)在啟動(dòng)子區(qū)域中添加熒光素酶基因來(lái)檢測(cè)p53活性的變化，通過(guò)熒光素酶酶活性的檢測(cè)，可以監(jiān)測(cè)到p53基因所調(diào)控的同源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平和活性。p53基因在腫瘤診斷中的應(yīng)用p53基因與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。早期的研究表明，p53基因突變或缺陷會(huì)導(dǎo)致p53蛋白質(zhì)功能的喪失，從而失去對(duì)DNA損傷的修復(fù)和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用?；谶@一認(rèn)識(shí)，p53基因的檢測(cè)在腫瘤診斷和治療中逐漸變得重要。臨床上可以通過(guò)以下技術(shù)進(jìn)行p53基因檢測(cè)：（1）免疫組織化學(xué)染色：p53蛋白質(zhì)扮演了細(xì)胞核中的調(diào)節(jié)者角色，因此，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)p53蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定性和定量分析，可以幫助我們確定腫瘤的類(lèi)型和級(jí)別；（2）Sanger測(cè)序：通過(guò)PCR擴(kuò)增p53基因并應(yīng)用Sanger測(cè)序技術(shù)，可以檢測(cè)p53基因序列中的單核苷酸多態(tài)性和突變等變異信息，同時(shí)還可以判斷突變對(duì)p53基因蛋白質(zhì)功能的影響；（3）熒光原位雜交技術(shù)：通過(guò)對(duì)腫瘤樣本中p53基因的熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行分析，可以幫助我們對(duì)p53基因的數(shù)量和突變狀態(tài)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的鑒定，從而提高腫瘤的診斷和治療的精確度和準(zhǔn)確性。結(jié)論p53基因的克隆表達(dá)技術(shù)和活性測(cè)定技術(shù)是腫瘤生物學(xué)研究中非常重要的組成部分，可幫助我們更好地理解p53基因的生物學(xué)功能和與腫瘤發(fā)生