SNT 1695-2006馬焦蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作規(guī)程

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)馬焦蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作規(guī)程2006-01-26發(fā)布2006-08-16實(shí)施國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)OIE《診斷試劑和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》(2004)第五版第2.5.6章制定。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬焦蟲病微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的操作方法。-本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬屬動(dòng)物馬焦蟲病的血清學(xué)診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3試劑和材料3.1.1試驗(yàn)用蒸餾水為GB/T6682中的三級水。3.1.2稀釋液：巴比妥級沖液(見第A.2章)。3.2被檢血清3.2.1采血和分離血清3.2.2運(yùn)送和保存血清血清采用冷藏運(yùn)送。若3d內(nèi)不能送到實(shí)驗(yàn)室，用冷凍方法運(yùn)送。3.3.1玻璃試管：10mm×75mm.圓底潔凈反應(yīng)管。3.3.3微量移液器。3.3.4可調(diào)連續(xù)加樣器。3.3.596孔“U”型微量板。4操作方法4.1預(yù)備試驗(yàn)4.1.13%紅細(xì)胞懸液的制備4.1.1.1綿羊全血充分混勻后，取所需量用稀釋液洗三次，每次2000r/24.1.1.5用酶標(biāo)儀于540nm波長下讀光密度值(OD值),算出平均OD值，代入校正紅細(xì)胞濃度公稀釋液加入量=平均OD值×紅細(xì)胞懸液量/0.115一紅細(xì)胞懸液量 (1)4.1.1.6取校正紅細(xì)胞濃度時(shí)所需的稀釋液量加入到紅細(xì)胞懸液中即得3%紅細(xì)胞懸液。4.1.2溶血素效價(jià)的測定4.1.2.1稀釋溶血素取0.2mL溶血素原液，加入到19.8mL生理鹽水中，制成1:100倍稀釋的溶血素，再按表1稀釋成不同稀釋倍數(shù)的溶血素。稀釋倍數(shù)溶血素量溶血素1.0溶血素2.0溶血素0.5溶血素0.5溶血素1.0溶血素1.0溶血素1.0巴比妥緩沖液4.04.04.1.2.2制備不同稀釋倍數(shù)的溶血素致敏紅細(xì)胞取7個(gè)試管，每管加1.5mL3%的紅細(xì)胞懸液，然后分別緩慢加入不同稀釋倍數(shù)的溶血素1.5mL,4.1.2.3溶血素效價(jià)的確定將補(bǔ)體原液預(yù)稀釋至1:150,按表2于96孔“U”型微量板上測定溶血素效價(jià)。表2溶血素效價(jià)測定單位為微升孔號1234567稀釋液不同稀釋倍數(shù)致敏紅細(xì)胞溶血素稀釋倍數(shù)感作37℃水浴振蕩30min(每隔5min振蕩1次，下同)2000r/min水平離心3min,取上清液100μL分別注人另一96孔“U”型微量反應(yīng)板中，與標(biāo)準(zhǔn)比色孔比較，確定出現(xiàn)100%溶血時(shí)溶血素的最高稀釋倍數(shù)為其效價(jià)，即此時(shí)溶血素的濃度為該反應(yīng)體系下的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，正式試驗(yàn)時(shí)溶血素的工作濃度為2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位。4.1.3制備致敏紅細(xì)胞懸液按測定的溶血素效價(jià)稀釋溶血素，緩慢加入到等量的3%綿羊紅細(xì)胞懸液中，混合均勻，置37℃水浴箱中感作15min。4.1.4補(bǔ)體效價(jià)的測定補(bǔ)體預(yù)稀釋至1:150,做2組重復(fù)，按表3在96孔“U”型微量板上進(jìn)行測定。3表3補(bǔ)體效價(jià)測定單位為微升孔號123456稀釋液第一次感作37℃水浴振蕩30min致敏紅細(xì)胞第二次感作37℃水浴振蕩30min2000r/min水平離心3min,取上清液100μL分別轉(zhuǎn)移入另一96孔“U”型微量板中，于540nm度為此反應(yīng)體系下1個(gè)補(bǔ)體標(biāo)準(zhǔn)單位。正式試驗(yàn)補(bǔ)體工作濃度為2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位。4.1.5抗原效價(jià)的測定4.1.5.1新購抗原可按說明書稀釋使用。a)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清分別用稀釋液作1:5稀釋，置58℃水浴箱中滅能30min。c)將抗原按1:10作倍比稀釋(見附錄B)。d)建立方陣試驗(yàn)，用96孔“U”型微量板按附錄B進(jìn)行。e)取出微量反應(yīng)板，2000r/min水平離心3min,與標(biāo)準(zhǔn)比色孔(比色孔的配制見附錄C)比較，4.2.1滅能將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清和被檢血清置58℃水浴箱內(nèi)滅能30min;驢、騾血清于62℃滅能30min。4.2.2試劑及血清稀釋4.2.2.1試劑的稀釋4.2.2.2血清的稀釋4.2.3.1基本操作程序4.2.3.2定性試驗(yàn)加樣法每個(gè)已稀釋的樣品加3個(gè)孔，第一孔不加抗原，加等量稀釋液代替，作為抗補(bǔ)體對照。4.2.3.3血清效價(jià)測定加樣法4出微量反應(yīng)板，2000r/min水平離心1min,比照標(biāo)準(zhǔn)比色孔，記錄結(jié)果。表4血清效價(jià)的測定單位為微升孔號血清試驗(yàn)孔血清抗補(bǔ)體對照抗原對照補(bǔ)體對照.紅細(xì)胞對照2個(gè)補(bǔ)體單位1個(gè)補(bǔ)體單位0個(gè)補(bǔ)體單位***·血清***-———--—抗原—-——稀釋液——#****補(bǔ)體**0第一次感作37℃水浴振蕩感作40min致敏紅細(xì)胞第二次感作37℃水浴振蕩感作30min5.1被檢血清效價(jià)的確定比照標(biāo)準(zhǔn)比色孔判讀，達(dá)到50%抑制溶血時(shí)血清的最高稀釋度為該血清的效價(jià)。1個(gè)單位補(bǔ)體對照：50%溶血。抗原對照：100%溶血。血清抗補(bǔ)體對照：抗補(bǔ)體對照孔應(yīng)為100%溶血。如果抗補(bǔ)體對照孔與試驗(yàn)孔的抑制溶血程度相被檢血清1:5倍稀釋，抑制溶血大于等于50%判為陽性；小于50%判為可疑；完全不溶或痕量溶5(規(guī)范性附錄)A.1阿氏液(Alsever’s)的制備無水檸檬酸鈉8.00g葡萄糖20.5g蒸餾水至1.000mL5,5二乙基巴比妥鈉氯化鈉六水合氯化鎂氯化鈣蒸餾水 卻后加入1000mL鹽溶液中，最后用蒸餾水補(bǔ)至2000mL,混勻，0.104MPa～0.112MPa滅菌20min,分裝儲存于4℃?zhèn)溆谩Ｓ梅ǎ河们皩⑺湟后w用蒸餾水作1:5稀釋，調(diào)pH值至7.4。6(規(guī)范性附錄)抗原效價(jià)測定表表B.1方陣試驗(yàn)單位為微升孔號抗原稀釋度血清對照抗原對照補(bǔ)體對照紅細(xì)胞對照抗原———陽性血清———-——————-補(bǔ)體工作效價(jià)稀釋液————第一次感作37℃振蕩感作40min致敏紅細(xì)胞第二次感作37℃振蕩感作30min注：抗原對照、補(bǔ)體對照、血清對照為100%溶血，且紅細(xì)胞對照不溶血，試驗(yàn)成立。抗原與陽性血清各稀釋度發(fā)生抑制溶血最強(qiáng)的抗原最高稀釋度為抗原效價(jià)，其含址為1個(gè)單位，(規(guī)范性附錄)標(biāo)準(zhǔn)比色孔的制備取3%綿羊紅細(xì)胞3.0mL,加入到9.6mL蒸餾水中，充分破解，再加入4.25%氯化鈉2