SN-T 1316-2011牛海綿狀腦病檢疫技術規(guī)范

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準代替SN/T1316—2003牛海綿狀腦病檢疫技術規(guī)范國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草?！黾恿嗣嘎?lián)免疫吸附試驗方法(ELISA);——增加了免疫層析試紙條檢測方法。) SN/T1316-2003.1牛海綿狀腦病檢疫技術規(guī)范1范圍酶聯(lián)免疫吸附試驗方法、免疫層析試紙條檢測方法等檢測方法的技術要求和操作規(guī)范。其中組織病理學檢查方法為免疫組織化學方法的輔助方法，免疫組織化學方法和SAF蛋白免疫印跡診斷為確診方法，蛋白免疫印跡方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗方法和免疫層析試紙條檢測方法為篩選方法。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3臨床診斷3.1牛海綿狀腦病(BSE)平均潛伏期為4年～5年。病牛臨床表現(xiàn)為精神異常、運動障礙和感覺障礙。3.4感覺障礙：最常見的是對觸摸、聲音和光過度敏感，這是BSE病牛很重要的臨床診斷特征。用手4.1采樣及樣品準備方法4.1.1.1被檢組織10%中性福爾馬林溶液(見附錄A);消毒液：2%次氯酸鈉，2mol/L氫氧化鈉；98%～99%甲酸；無水乙醇；95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；二甲苯；石蠟(熔點為54℃~56℃,56℃~58℃,58℃~60℃)。24.1.1.3儀器設備4.1.2.1牛腦組織的采集4.1.2.1.1疑似患有BSE的病牛在戀要圖1腦閂部位的取材4.1.2.2牛海綿狀腦病組織病理學、免疫組織化學診斷樣品制備方法3A-A=延髓腦閂部位B-B=延髓小腦后腳部位b)側(cè)面4.1.2.2.1.4將所取樣品固定于10倍體積的10%的中性福爾馬林溶液中。通常情況下(室溫18℃~25℃),3d后更換固定液。固定1周即可進行修樣。4.1.2.2.1.6將裝有組織的脫水包理盒浸入98%～99%的甲酸溶液中，振蕩1h。a)10%中性福爾馬林溶液30min;b)70%乙醇75min;c)95%乙醇75min;d)95%乙醇75min;h)二甲苯30min;i)二甲苯45min;j)二甲苯45min;k)石蠟(熔點58℃~60℃)75min;m)石蠟(熔點58℃~60℃)1h。4.1.2.2.3包埋(使用包埋機或手工包埋，包埋石蠟熔點58℃~60℃)4切片機手柄切片。將所用器械浸泡于2mol/L氫氧化鈉溶液中2h后充分沖洗。剩余的樣品重新放回福爾馬林容器中，容器置于通風櫥中至做出診斷。4.1.2.3.1樣品編號。4.1.2.3.2所有的樣品通過完成檢測記錄能夠追蹤到。先稱量的勻漿管中，組織塊應在0.45g～0.70g之間(最好是0.5g～0.55g)。4.1.2.3.5在切板上修整組織塊，用紙巾吸取多余的血液。用2%的漂白粉消毒切板和紙巾1h,沖洗。把器械放入2mol/L的氫氧化鈉浸泡2h,沖洗。在生物安全柜中將紙巾放入開口的生物危害袋4.1.2.3.6在放入組織塊的勻漿管中加入10倍體積的1×勻漿緩沖液(質(zhì)量濃度),蓋上蓋子。4.1.2.3.7用FASTH1)或MediFASTHI)勻漿機自動勻漿45s。4.1.2.3.8每份樣品吸取900μL～1000μL勻漿組織液到96孔1.2mL的樣品主板里。和消化板每板有48份樣品。4.2.1.1.1待檢牛腦組織切片。4.2.1.2.4飽和碳酸鋰溶液。4.2.1.2.5伊紅染色液(見A.2)。54.2.1.2.6二級水(見GB/T6682)。4.2.1.3儀器設備4.2.1.3.4蓋玻片。4.2.1.3.5染色架。4.2.1.3.6溫箱或恒溫孵育器(58℃~60℃)4.2.2方法將待染切片置于58℃~60℃的溫箱中至少1b進行熔蠟。4.2.2.2蘇木素-伊紅(H.E)染色將待檢牛腦組織切片和對照組織切片置于染色架上，放入自動染色機，也可以手動染色。染色程序a)二甲苯3min~10min;b)二甲苯3min～10min;c)100%乙醇3min～10mh;d)100%乙醇3min～10nlin;e)95%乙醇3min～5mif;f)95%乙醇3min～5min;g)70%乙醇3min～5min;h)自來水洗1min～3minAi)蘇木素10s(根據(jù)染色液狀況調(diào)整);j)自來水洗4min～10min;k)飽和碳酸鋰1min～2min;1)自來水洗4min～10min;m)70%乙醇1min～3min;n)伊紅1min～5min;o)95%乙醇1min～3min;p)95%乙醇1min~3min;q)100%乙醇1min～3min;r)100%乙醇1min～3min;s)二甲苯1min～3min;t)二甲苯1min～3min;u)二甲苯3min～5min。64.2.3結(jié)果解釋注，在特定的解剖學部位未見上述特征性病理變化不能排除待檢樣品為陽性的可能，應結(jié)合免疫組織化學染色結(jié)4.3免疫組織化學診斷方法4.3.1.1.1待檢牛腦組織。74.3.1.1.3陽性對照腦組織切片。4.3.1.2.398%～99%甲酸。4.3.1.2.4磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST),(pH7.4)(見附錄A)。4.3.1.2.5抗原修復緩沖液(見附錄A)。4.3.1.2.6正常羊血清工作液。4.3.1.2.7抗體稀釋緩沖液。4.3.1.2.83%過氧化氫甲醇溶液。4.3.1.2.10二級水(見GB/T6682)。4.3.1.2.11蘇木素染色液(Gill's)。4.3.1.3儀器設備4.3.1.3.6溫箱或恒溫孵育器(37℃,58℃~60℃)。4.3.2方法將待染切片置于58℃~60℃的溫箱中至少1h進行熔蠟。將放有切片的染色架放入白動染色機脫蠟、脫二甲苯，也可手動進行。程序如下8a)二甲苯5min;b)二甲苯5min;f)70%乙醇3min;g)自來水洗2min;h)二級水1min。4.3.2.3過氧化氫甲醇溶液處理將切片從切片機中取出，放入3%過氧化氫甲醇溶液中10min。二級水沖洗1min。放入98%～99%甲酸中5ming二級水沖洗2次，每次1min。PBST(pH7.4),3min。PBST(pH7.4),5min。將放有切片的染色架置于抗底修復液中，121℃高壓2min~30/min(根據(jù)使用的一抗來確定高壓4.3.2.11免疫組織化學手動染色4.3.2.11.1在玻片組織上滴加正常羊血清100μL,室溫濕盒中孵育15min。4.3.2.11.3從冰箱中取出玻片室溫下放置15min。4.3.2.11.4PBST(pH7.4)中洗5min,其間振蕩。4.3.2.11.6PBST(pH7.4)中洗2min×3次，其間振蕩。94.3.2.11.7滴加300μLDAB,室溫反應15min。4.3.2.12免疫組織化學自動染色a)正常羊血清100μL,15min;b)吹去羊血清；c)一抗工作液100μL,1h;d)PBST(pH7.4)洗3次；f)PBST(pH7.4)洗3次；h)二級水洗3次；蘇木素10s(根據(jù)染色液狀況調(diào)整)。自來水洗5min。飽和碳酸鋰1min。自來水洗4min。70%乙醇1min。95%乙醇1min。95%乙醇1min。100%乙醇1min100%乙醇1mih。二甲苯1min。二甲苯1min。二甲苯3min。顯微鏡下觀察陰性對照、陽性對照組織切片以及待檢腦組織切片，記錄對照切片和待檢切片的染色4.3.3結(jié)果判定纖維的顆粒狀染色是該病典型的染色模式。被檢牛腦組織切片沒有呈現(xiàn)特異性的PrPRe陽性染色，顯微特征與陰性對照片或無一抗對照片4.4.1材料4.4.1.1被檢組織4.4.1.2.1解剖刀柄和一次性刀片。4.4.1.2.4勻漿機(FAST-H或Medi-FAST)。4.4.1.2.10快封超速離心管。4.4.1.2.16帶犀角杯的超聲破碎儀。4.4.1.2.18加熱器(dryblockheater)為2ml.微離心管加熱到100℃。4.4.1.2.29塑料或玻璃插入物可嵌入膠片盒中。4.4.1.2.40酸度計和電極試劑。4.4.1.3材料和試劑4.4.1.3.112%Bis-Tris,1.0mm-12孔預制凝膠(或自制12%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠)。4.4.1.3.3堿性磷酸酶標記山羊抗鼠IgG。4.4.1.3.5SDSMOPS電泳緩沖液。4.4.1.3.6抗氧化劑(Antioxidant)。4.4.1.3.8HPLC級100%甲醇。4.4.1.3.13N-lauroysarcosine。4.4.1.3.1737%鹽酸。4.4.1.3.20N-乙基-甲酰胺[N-ethyl-maleimide(NEM)]。4.4.1.3.21蛋白酶K(PK)。氫氧化鈉(5.25%或12%)。即用型CDP-Star堿性磷酸酶底物(0.25mmol/L)。腦組織裂解緩沖液、0.01mol/LPBS(pH7.TBST(TBSwithTween,pH7.4)、100mmol/LPMSF、100mmol/LNEM、20%蔗糖、15%和10%KI4.4.2方法4.4.2.1按以下方法從腦干的腦月區(qū)獲得的樣品：ELISAOD值1～2.52g腦于組織(全部PK處理)。4.4.2.2在10mL的腦組織裂解緩師液(BrainLysisBuffer,BLB)含有10μL的NEM和10μL的c)1g組織：0.5g組織在5mL×陽性對照和測試樣品應使用MEDIFAST在生物安全柜中分漿。陰性對照可使用MEDIFAST或FASTH勻漿。勻漿之后每份樣品加2滴～3滴正辛醇減少產(chǎn)生的氣泡。4.4.2.3轉(zhuǎn)移勻漿到快封管里再用BLB進行平衡。封，在放入轉(zhuǎn)頭前使表面消毒。4.4.2.4以17000r/min在10℃條什下離心30mink4.4.2.6用BLB充填至管頸處(同時用BI6進行平衡),4.4.2.7以46000r/min在10,℃4.4.2.8次日繼續(xù)以46000r/min在10℃條件下離心105min,/在生物安全柜中打開轉(zhuǎn)頭，取出離a)4g組織+3mL水+50μL1mol/LTrisHCl;b)1g～2g組織+1.5mL水+25μL1mol/LTrisHCl。轉(zhuǎn)移至15mL離心管。4.4.2.10在37℃孵育樣品15min。偶然攪拌樣品。4.4.2.11按以下方法加15%KI-HSB,在37℃孵育樣品30min。偶爾攪拌樣品a)4g組織+6mL15%KI-HSB;b)1g~2g組織+3mL15%KI-IISB。4.4.2.12將陰性對照分成兩份到15mL離心管里，每份4.5mL進行PK+和PK-處理a)1g～2g組織+45μL1mg/mLPK;在37℃孵育樣品60min。偶然攪拌樣品。a)加4.5mL10%KI-HSB,b)小心加2mL20%蔗糖液到離心管底部，用10%KI-HSBc)以51000r/min在10℃條件下離心60min。4.4.2.15去除上清液，懸浮沉淀于40μLP4.4.2.16超聲設定超聲能量為10級4.4.2.19加熱樣品到95℃5hin。加熱控制梯度為每2min65℃4.4.2.20加載2μL樣品至12%Bis-Tris膠。加載8μL的對照和μLmarker。4.4.2.21加500μL抗氧化劑到丙層電泳槽，電泳200V40min4.4.2.22在甲醇中浸泡轉(zhuǎn)移膜5min,然后使膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少10min?！?片濾紙侵入轉(zhuǎn)移緩沖被。4.4.2.24半干轉(zhuǎn)移在15V50min。4.4.2.25用封閉液封閉30min。4.4.2.26用一抗液孵育膜1h,TBS-T洗滌3次，每次5min。4.4.2.27用二抗液孵育膜30hin,TBS-T洗條5次，每次5min。4.4.2.28在化學發(fā)光緩沖液皇平衡膜5min。4.4.2.29轉(zhuǎn)移膜至玻璃盤中在2mL的0,zsmmpí/Lcnp-Star孵育膜5min。4.4.2.32曝光30s,或2min5min,8min。4.4.3結(jié)果判定4.4.3.1陰性結(jié)果未經(jīng)PK處理時在33kDa～35kDa有條帶。詳細的結(jié)果判定可參照4.5.4進行。4.5蛋白免疫印跡試驗4.5.1.4DispensetteⅢEasyCal1mL～14.5.1.5主板96孔板，每孔至少容納1mL。4.5.1.8干式加熱器：48℃和96℃96孔PCR板。4.5.1.10Nupage12%Bis-Trisgels,17wells。4.5.1.12轉(zhuǎn)印濾紙。4.5.1.14正方形的帶蓋的孵育盤。4.5.1.22膠片hyperfilm8×10。4.5.1.284℃士3℃的冰箱。4.5.1.29-20℃±5℃和-70℃士10℃冰箱。4.5.1.31達到135℃的高壓滅菌鍋。4.5.1.34解剖刀柄和可調(diào)換式刀片。4.5.2材料和試劑4.5.2.112%Bis-Tris,1.0mm-12孔預制凝膠(或自制12%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠)。4.5.2.3堿性磷酸酶標記山羊抗鼠IgG。4.5.2.5SDSMOPS電泳綏沖液。4.5.2.8甲醇100%HPLC級CH?OH,F.W.32.04g。4.5.2.13N-lauroysarcosine。4.5.2.15磷酸二氫鈉。4.5.2.1737%鹽酸。4.5.2.20N-ethyl-maleimide(NEM)。4.5.2.21蛋白酶K。4.5.2.22甘氨酸C?H?NO?,F.W.75.06g。4.5.2.23氫氧化鈉(5.25%或12%)。4.5.2.25CDP-Star堿性磷酸酶底物(APS)(12.5mmol/L或25mmol/L)。4.5.2.27腦組織裂解緩沖液、0.01mol/LPBS(pH7.4TBST(TBSwith吐溫-20,pH7.4)、100mmol/LPMSF、100mmol/LNEM、20%蔗糖、15%和10%KI,4.5.3.1.2所有的樣品通過完成檢測記錄能夠追蹤到。4.5.3.1.4在BⅡ生物安全柜或安全罩內(nèi)從延髓的腦閂部位切取一塊組織，把腦閂切塊放入天平上事先稱過皮重的勻漿管中，組織塊應在0.45g～--0.70g之間(最好是0.5g～0.55g)。4.5.3.1.5在切板上修整組織塊，用紙巾吸取多余的血液。用2%的漂白粉消毒切板和紙巾1h,沖洗。把器械放入2mol/L的氫氧化鈉浸泡2h,沖洗。在生物安全柜中將紙巾放入開口的生物危害袋4.5.3.1.6在放人組織塊的勻漿管中加入10倍體積的1×勻漿緩沖液(質(zhì)量濃度),蓋上蓋子。4.5.3.1.7用FASTH或MediFASTH勻漿機自動勻漿45s。4.5.3.1.8每份樣品吸取900μL～1000μL勻漿組織液到96孔1.2mL的樣品主板里。注：從現(xiàn)在開始，每一步驟要做兩個重復，主板可在4℃保存或在-20℃或一70℃長期保存(12個月)。所有步驥4.5.3.5用多道移液器從主板中取各份裂解液100gL轉(zhuǎn)人消化板，吹打混勻(8次～10次),吸取每一組樣品后要換槍頭。注：在孵育期準備17孔12%NuPAGE膠，首先小必地把桃子拔出，據(jù)排膠底部的白色塑料箔，每48份樣品(一個膠槽3cm～5cm,在轉(zhuǎn)印槽中加入1×轉(zhuǎn)印級沖液，打開冷卻裝置預冷轉(zhuǎn)印緩沖液。4.5.3.9在加熱器中96℃孵育5min,不要使用封板膜消化板可以蓋上封板膜在一20℃至-80℃之間放置5d(以前在96℃孵育過的舊竹品要加熱到G5℃2nin)。4.5.3.10對照樣品加熱65℃2yhin(可以在烤霜中操作)。4.5.3.11在左邊的第一道中加人8μ1(10μL)對照樣品(僅用y1,就有強的信號)。4.5.3.14在內(nèi)槽中加入500L抗氧化劑。4.5.3.15200V電泳，至染色線距離膠底部1cm～2cm。(大約30hin)。4.5.3.22在有連續(xù)致冷和混合的4℃條件下，140V～150V轉(zhuǎn)印1h。正極(+)海綿墊海綿墊 轉(zhuǎn)印膜 JQJSSSSA凝膠 負極(-)4.5.3.24圖4蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜裝載示意圖用TBST沖洗PonceauS直至紅色消尖(大約2×}mim)。倒掉TBST,根據(jù)膜的大小加入適量的PYDF封閉緩沖液，在板面搖床上室溫下振蕩4.5.3.26倒掉PVDF封閉緩沖板，根據(jù)膜的大示用TRST配制適量的一抗(6H4),加入膜上在板面搖床上室溫下振蕩1h或4℃過諫。4.5.3.28倒掉最后一次的TBST洗滌液，根據(jù)膜的大少用TBST配制適量的二抗(AP),加入膜上在板面搖床上室溫下振蕩30min。4.5.3.29用50mLTBST洗膜，每次5min,洗5次。4.5.3.30倒掉最后一次的TBST洗滌液，用擊離子水配制50ml.一倍發(fā)光緩沖液，取適量的發(fā)光級沖液加入另一個單獨的管中，加入膜上振蕩5hin。4.5.3.31加入適量的CDP-Star(12.6mmol/L:50×)或(25mol/L;100×)到已倒掉部分的發(fā)光緩沖液中，黑暗中保存直至使用。4.5.3.32倒掉發(fā)光緩沖液，把膜從塑料孵育盒中拿出，放匿在塑料或玻璃平板插入物上。在上面均勻地涂上適量的稀釋過的CDP-StaL溶液中，室溫5mín,確保整個過程中整個膜處于濕潤狀態(tài)。4.5.3.33用軟的面巾紙從膜上移去剩余的發(fā)光緩沖液(木要使膜完全變干),立即用塑料膜覆蓋，消除塑料膜下面折痕和氣泡，放入膠片盒中。4.5.3.34進入暗室，使膜曝光到X光片(HyperFilm),直到陽性對照的強信號出現(xiàn)和膜背景或蛋白酶K帶出現(xiàn)，(大約4min～8min),為達到出現(xiàn)最佳可見信號曝光時間可以更長或更短。也可使用CCD-照相機檢測系統(tǒng)。4.5.4.1圖5分別表明BSE陰性、BSE陽性和對照樣品預期的帶型。對照樣品(K)含有朊病毒蛋白PrP的正常構(gòu)型，通過免疫檢測可以顯現(xiàn)出來，由于PrP*糖基化的不同造成的異類分布，相應的分散帶在25kDa～35kDa之間分布。4.5.4.2陰性樣品(N)沒有特異信號帶。由于二抗非特異地結(jié)合蛋白酶K形成的31kDa帶(不一定出現(xiàn)),可以用來定位。4.5.4.3陽性樣品(包括強陽性和弱陽性)顯示的信號包括3條帶，最上面的帶(A)對應大約為30kDa的蛋白質(zhì)，所有帶的信號強度可能比此處描述的要弱(尤其是低點的B帶和C帶),但頂端的帶圖5蛋白免疫印跡試驗結(jié)果判定示意圖4.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)4.6.1儀器和設備4.6.1.6微型檢測管加熱孵育器37℃。4.6.1.7微型檢測管加熱孵育器100℃。4.6.1.92mL微型離心管的離心機(15000g,20℃)。4.6.1.10Eppendorf轉(zhuǎn)子離心架(最少6)。4.6.1.14可調(diào)移液器(50μL,100μL,200μL和1000μL)和槍頭。4.6.1.1510mL,20mL和100mL刻度管或15mL和50mLFalcon管。4.6.1.17自動或半自動微板洗板機4.6.1.19680微量板讀板儀機附件串口連接線。4.6.1.20680微量板讀板儀620nm濾光片。4.6.1.21冰箱(4℃~8℃)/低溫冰箱(-20℃)。4.6.1.24蒸汽滅菌器(溫度不低于135℃,且蒸汽不外排)。4.6.1.29能存貯20L廢液的塑料桶。4.6.2.1純化和檢測試劑盒包含的材料4.6.2.1.1純化試劑盒含有苯酚做為指示顏色的蛋白酶K,一瓶(0.5mL)。4.6.2.1.2.2R2,洗滌液：10倍濃縮含有0.01%硫柳汞鈉的pH7.4Tris-NaCl(250mL)。4.6.2.1.2.3R3,陰性對照：含0.1%Proclin300的BS4.6.2.1.2.4R4,陽性對照：含0.1%Proclin300和無感染合成肽(凍干)的pH7.4的PBS,一瓶。4.6.2.1.2.5R6,樣品稀釋液，含酚紅和0.1%用新鮮配制的洗滌液以1:10稀釋。4.6.2.1.2.7R8,過氧化物酶底物緩沖液：含有0.015%H?O?和4%二甲基亞砜的pH4.0的檸檬酸以1:11稀釋來配制底物4.6.2.2必需試劑4.6.2.2.22%次氯酸鈉。4,6.2.2.32mol/L氫氧化鈉。4.6.3試驗前準備4.6.3.1蛋白酶K:用試劑A做為蛋白酶K的稀釋緩沖液。配制見表1。表1試劑配制試劑A蛋白酶K220pl.4.6.3.2洗滌液(R2):1:10溶解MilliQ900mL4.6.3.3陽性對照(R4)R70.1mLR2(稀釋過的)0.9mL4.6.3.5底物溶液(R8+R9):1:11溶解R90.1m4.6.4樣品的準備組織塊應在310mg～390mg之間(最好是0.35g),如果首選的話，樣品也可直接在稱過重的研磨管中4.6.4.3把這些管放入到TeSeEPrecess48的頂部中，用程序1執(zhí)行1個攪動循環(huán)(Precess48)。4.6.5試驗操作4.6.5.1樣品純化4.6.5.1.1從勻漿器中取出研磨管。4.6.5.1.4把這250μL樣品加入到2mL離心管中。4.6.5.1.7在加入試劑B30min之內(nèi)，20℃,20000g5min離心此離心管，或15000g7min離心。4.6.5.1.8離心完后，在廢液罐上顛倒棄去上清液，顛倒放置在吸水紙上最少5min干燥離心管4.6.5.1.10立即在100℃下孵育5min,在吸取試劑C和開始孵育之間不要超過2min。4.6.5.1.11從孵育器中取出離心管，旋渦5s。4.6.5.2.1取125pL試劑R6稀釋純化過的樣品。4.6.5.2.2在加入微量板之前旋渦5s。4.6.5.2.4準備陽性對照R4(見4.6.3.3)?！譇1,B1,C1,D1:100μL陰性對照R3;——孔E1,F1:100μL陽性對照R4;4.6.5.2.8準備結(jié)合物溶液R7(見4.6.3)。4.6.5.2.11用封口膜覆蓋2℃~8℃下孵育60min。4.6.5.2.12準備底物溶液(過氧化物酶底物緩沖液R8和顯色劑R9,見4.6.3),配好的試劑在檢測使用前要防光。4.6.5.2.15以加入底物溶液同樣的順序和速度每孔加入100μL終止液。4.6.5.2.16徹底擦一下板子的底部，然后放入讀板儀。終止反應后30min內(nèi)在450nm～620nm下臨界值=0.020+0.210=0.230等于0.150時，要排除這個最大異常值。如果一個以士的陰性對照超出這個界限，則需重做(ODR3+40%)的值應排除； 陽性對照光密度平均值(R4OD’s)應大于或等于1.000,如果陽性對照光密度平均值(R4OD’s)確4.6.6.2結(jié)果判定4.7免疫層析試紙條檢測法4.7.1儀器和設備4.7.1.8勻漿機FASTH或Medi-FASTH。4.7.1.11主板96孔板，每孔至少容納1mL。4.7.1.16Falcon管(15mL和50mL)4.7.1.18冰箱5℃±3℃。4.7.1.19-20℃±5℃和-70℃E10℃冰箱。4.7.1.20達到135℃的高壓滅菌鍋。4.7.2.1.2消化緩沖液(1×):即用。4.7.2.2.2陽性對照(凍干):加水和試驗緩沖液復原(見4.{.3)。4.7.2.2.3陰性對照(凍于);加水和試驗緩沖液復原(見4.1.4)。4.7.2.2.5試紙條梳子：即用。4.7.3試驗前準備表2消化液配制板子數(shù)量消化液體積ml.勻漿工作液體積消化緩沖液體積6排316234566按照上表在塑料Falcon管中混合。在22℃±3℃下可保存15min±1min。4.7.3.1.5結(jié)合物：一小瓶里面加入9mL結(jié)合物緩沖液復原，每次使用前至少15s劇烈旋渦，在5℃±3℃下可保存1周。4.7.3.2準備樣品稱量。組織塊應在0.45g～0.70g之間(最好0.5g～0.55g)。毒1h,充分沖洗切板?？稍俅问褂玫墓ぞ哂?mol/L氫氧化鈉浸泡1h,充分沖洗。把紙巾放人開口的全柜中完成)。4.7.3.2.7使用FASTH或MediFASTH勻漿機對組織自動勻漿45s。4.7.3.2.8對每一個樣品。吸取1000μL勻漿過的樣品加入到96孔主板里。4.7.4試驗操作4.7.4.5用封口膜蓋住消化板，放入加熱器中47℃士1℃60min±2min,消化板在—4.7.4.7加入150μL試驗緩沖液(使用前至少渦旋10s徹底混勻)到消化板的每個孔中，來回吹打至盒對照孔中(A1和B1)。4.7.4.8室溫下孵育15min±lmin。4.7.4.9在孵育期復原實用陽性和陰性對照(見4.7.3)。4.7.4.11分別取12μL復原好的陰性對照和陽性對照加入檢測板(白板)的B1孔和A1孔。4.7.4.16室溫下作用20min。4.7.4.1710min內(nèi)肉眼觀察變化或用專用的儀器讀數(shù)并分析來判定結(jié)果。4.7.5試驗結(jié)果判定和檢測線(對照線下1mm～2mm)都出現(xiàn)(見圖6)。無效結(jié)果：沒有線出現(xiàn)或僅有檢測線出現(xiàn)。如果圖6免疫層析試紙條試驗結(jié)果判定示意圖試劑的配制A.110%中性福爾馬林溶液稱取磷酸氫二鈉117g,磷酸二氫鈉72g,溶解于16.2L二級水中。在通風櫥中向配好的級沖液中加入37%的甲醛溶液1.8L。攪拌均勻，將pH值調(diào)至7.0±0.2。730mL去離子水+250mL已烯基甘油+2.0g蘇木素÷0.2g碘酸鈉+17.6g硫酸鋁+20mL冰A.3伊紅染色液0.5g～1g伊紅(醇溶)+100mL95%乙Na?HPO?1.44g加800mL蒸餾水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至7.4,再加蒸餾水至1000mL,121℃±2℃,20min高壓1000mL磷酸鹽緩沖液(PβS)(pH7)4)加入500μL吐溫-20;混勻，為含1%BSA的PBST。A.7抗原修復緩沖液0.5mol/LEDTA緩沖液(H8.0):700ml.水中溶解186.1gEDTA·2H?O,用10mmol/L氫氧化鈉調(diào)至pH8.0,加水至1000mlA.8