第十一章色譜法基本概念及經(jīng)典液相色譜法

第十一章色譜法基本概念及經(jīng)典液相色譜法第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2◆學(xué)習(xí)目的通過學(xué)習(xí)色譜法基本概念、基本類型、分離機制以及各種經(jīng)典液相色譜法的固定相、流動相及其選擇等相關(guān)知識，了解色譜法的特點及其應(yīng)用，會利用吸附色譜、分配色譜等經(jīng)典柱色譜法和薄層色譜法對試樣進行分離分析。為氣相色譜法和高效液相色譜法的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)，同時也為學(xué)習(xí)藥物分析、天然藥物化學(xué)、藥物分離檢測技術(shù)等專業(yè)課程奠定基礎(chǔ)。第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3◆知識要求1．掌握色譜法的基本概念，吸附色譜法和分配色譜法的分離機制，薄層色譜法的基本原理及其應(yīng)用。2．熟悉色譜法的分類，離子交換色譜法和空間排阻色譜法的分離機制，各種經(jīng)典的柱色譜法和紙色譜法基本原理及其應(yīng)用。3．了解色譜法的由來，高效薄層色譜法及薄層掃描法的基本原理及應(yīng)用?！训?頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4◆能力要求熟練掌握薄層色譜法、柱色譜法及紙色譜法的操作技術(shù)，學(xué)會應(yīng)用薄層色譜法、紙色譜法等對物質(zhì)進行分離和鑒定。

⊙第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月5第一節(jié)概述

第一節(jié)

概

述

色譜法（chromatography）是一種根據(jù)物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)不同而進行分離分析的方法。

第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月6第一節(jié)概述一、色譜法的發(fā)展概況

色譜法的創(chuàng)始人是俄國植物學(xué)家Tsweet。20世紀30與40年代相繼出現(xiàn)了薄層色譜和紙色譜，與柱色譜一起統(tǒng)稱為經(jīng)典的液相色譜法，使色譜法成為一門分離技術(shù)。20世紀50年代氣相色譜的興起，使色譜法在理論、儀器以及分離與“在線”分析等方面得到長足發(fā)展，奠定了現(xiàn)代色譜法的基礎(chǔ)。第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月7第一節(jié)概述20世紀70年代高效液相色譜的崛起，彌補了氣相色譜不能直接用于分析難揮發(fā)、對熱不穩(wěn)定及高分子試樣等方面的不足，拓寬了色譜法的應(yīng)用范圍，成為色譜發(fā)展史上又一個里程碑。20世紀80年代是色譜迅猛發(fā)展的重要時期，相繼出現(xiàn)了液相色譜的各種聯(lián)用技術(shù)

。經(jīng)過一個多世紀的發(fā)展，色譜法已成為重要的分離分析方法。第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月8第一節(jié)概述二、色譜法的分類（一）按兩相的分子聚集狀態(tài)分類液相色譜法（LC）：流動相為液體的色譜法。氣相色譜法（GC）：流動相為氣體的色譜法。超臨界流體色譜法（SFC）：是以超臨界流體作為流動相的一種色譜法。

第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月9第一節(jié)概述（二）按操作形式分類柱色譜法（CC）:將固定相裝于柱管內(nèi)構(gòu)成色譜柱，色譜過程在色譜柱內(nèi)進行的色譜法，稱為柱色譜。平面色譜法:色譜過程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進行的色譜法，稱為平面色譜。第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月10第一節(jié)概述（三）按色譜過程的分離機制分類吸附色譜法（adsorptionchromatography，AC）分配色譜法（distributionchromatography，DC）離子交換色譜法（ionexchangechromatography，IEC）空間排阻色譜法（stericexclusionchromatography，SEC）第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月11課堂互動請您闡述色譜法的分類方法？第一節(jié)概述第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月12第一節(jié)概述三、色譜過程

色譜法具有相對運動的兩相，其一是固定不動的，稱為固定相（stationaryphase）；而另一相則是攜帶試樣向前移動的，稱為流動相（mobilephase）。色譜過程是物質(zhì)在相對運動的固定相和流動相之間達到分配平衡的過程。例：順式與反式偶氮苯的色譜過程。順式與反式偶氮苯的色譜過程示意圖a.加樣b.洗脫c.繼續(xù)洗脫1.順式偶氮苯2.

反式偶氮苯第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月13第二節(jié)色譜法的基本概念一、色譜圖色譜流出曲線（一）基線：是在操作條件下，僅有流動相通過檢測系統(tǒng)時所產(chǎn)生的信號曲線。（二）色譜峰：色譜流出曲線上的突起部分。分為對稱峰與不對稱峰，后者又分為前延峰和拖尾峰。第二節(jié)色譜法的基本概念

第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月14第二節(jié)色譜法的基本概念

色譜流出曲線和色譜峰區(qū)域?qū)挾?/p>

第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月15第二節(jié)色譜法的基本概念fs處于0.95～1.05之間為對稱峰；小于0.95者為前延峰；大于1.05者為拖尾峰。色譜流出曲線上，一個組分的色譜峰可用峰位、峰高或峰面積及色譜峰的區(qū)域?qū)挾鹊热梾?shù)描述，分別作為定性、定量及衡量柱效的依據(jù)。峰高（h）：色譜峰頂至基線的垂直距離。峰面積（A）：色譜峰與基線所包圍的面積。第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月16第二節(jié)色譜法的基本概念

標準差（

）：正態(tài)分布曲線上兩拐點間距離的一半。

半峰寬（W1/2）：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬。

W1/2=2.355

峰寬（W）：通過色譜峰兩側(cè)拐點作切線，在基線上所截得的距離稱為峰寬。

W=4

或W=1.699W1/2

色譜峰的區(qū)域?qū)挾?/p>

色譜峰的區(qū)域?qū)挾扔糜诤饬可V柱的柱效，區(qū)域?qū)挾仍叫?，色譜柱的柱效越高。

第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月17第二節(jié)色譜法的基本概念對稱峰與不對稱峰可用對稱因子（fs）或拖尾因子（T）來衡量。

對稱因子計算示意圖

第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月18第二節(jié)色譜法的基本概念二、保留值保留時間（tR）：進樣開始到某組分色譜峰頂點的時間間隔。死時間（tM或t0）：分配系數(shù)為零的組分（即不被固定相吸附或溶解的組分）的保留時間

。調(diào)整保留時間（t'R）：組分的保留時間與死時間之差。亦可認為是組分在固定相中的滯留時間。

t'R=tR-tM

第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月19第二節(jié)色譜法的基本概念保留體積（VR）：某組分在保留時間內(nèi)流動相流經(jīng)色譜柱的體積

。

VR=tR·Fc

死體積（VM或V0）：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占據(jù)的空間稱為死體積。

VM=tM·Fc

死體積大，色譜峰擴展，色譜柱的柱效降低。

第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月20第二節(jié)色譜法的基本概念調(diào)整保留體積（V

'R）：保留體積與死體積之差。

V'R=VR-VM=t'R

·Fc

問題您能說出色譜法定性、定量以及衡量柱效的依據(jù)嗎？第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月21第二節(jié)色譜法的基本概念三、分配系數(shù)和容量因子分配系數(shù)（distributioncoefficient，K）容量因子（capacityfactor，k）第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月22第二節(jié)色譜法的基本概念分配系數(shù)與容量因子的關(guān)系分配系數(shù)比（

）

第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月23第二節(jié)色譜法的基本概念分配系數(shù)、容量因子與保留值的關(guān)系

分配系數(shù)（或容量因子）越小，組分的遷移速度越快，保留時間越短，即先流出色譜柱；反之亦然。

分配系數(shù)（或容量因子）不等是組分分離的前提。

問題為什么說“分配系數(shù)不等是組分分離的前提”？第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月24第二節(jié)色譜法的基本概念四、分離參數(shù)分離度（resolution，R）

《中國藥典》2005年版規(guī)定：作定量分析時，為了獲得較好的精密度和準確度，應(yīng)使R≥1.5。問題兩相鄰色譜峰完全分離的判斷依據(jù)是什么？

第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月25第三節(jié)基本色譜法的分離機制

第三節(jié)基本色譜法的分離機制一、吸附色譜法分離機制吸附色譜法是以吸附劑為固定相，液體（或氣體）為流動相，利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異進行分離的色譜法。吸附是指溶質(zhì)在液-固（或氣-固）兩相的交界面上集中濃縮的現(xiàn)象。第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月26第三節(jié)基本色譜法的分離機制吸附色譜過程就是組分不斷被吸附、解吸附，再吸附、再解吸附，……，如此反復(fù)多次的過程。吸附平衡常數(shù)組分的吸附平衡常數(shù)越大，組分越容易被吸附，保留時間越長，遷移速度就越慢，即后流出色譜柱。第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月27第三節(jié)基本色譜法的分離機制

二、分配色譜法分離機制分配色譜法是利用混合物中的不同組分在固定相和流動相中的溶解度不同，即在兩相中的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的。分離機制：流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相時，各組分在兩相間不斷地進行溶解、萃取，再溶解、再萃取，……，如此多次后，使分配系數(shù)稍有差異的組分得以分離。第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月28第三節(jié)基本色譜法的分離機制三、離子交換色譜法分離機制離子交換色譜法是利用被分離組分離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離的。分離機制：被分離的離子隨流動相流經(jīng)離子交換樹脂時，與離子交換樹脂上可被交換的離子連續(xù)進行競爭交換，因不同離子與交換樹脂的競爭交換能力不同，其遷移的速度亦不同，交換能力弱的離子，遷移速度快，保留時間短，先流出色譜柱。第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月29第三節(jié)基本色譜法的分離機制離子交換反應(yīng)：

R-B+＋A+R-A+

＋B+離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)（KA/B）用于衡量離子對樹脂的親和能力，KA/B越大，說明A＋的交換能力大，保留時間長，則A＋比B＋后流出色譜柱；若KA/B較?。↘A/B＜1），說明B＋離子的交換能力大，保留時間長，則A＋比B＋先流出色譜柱。第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月30第三節(jié)基本色譜法的分離機制四、空間排阻色譜法分離機制空間排阻色譜法是利用被分離組分分子的大小或滲透系數(shù)的大小而進行分離分析的色譜法。分離機制：類似于反分子篩的作用（見右圖）。凝膠色譜分離機制示意圖O：凝膠顆粒o：大分子組分·：小分子組分第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月31第三節(jié)基本色譜法的分離機制

各組分在流經(jīng)凝膠表面時，由于小分子能完全滲透進入凝膠內(nèi)部孔穴而被滯留，中等分子可以部分進入較大的一些孔穴，大分子則完全不能進入孔穴而只能沿凝膠顆粒之間的空隙隨流動相流動。于是樣品中各組分按大分子、中等大小的分子、小分子的先后順序流出色譜柱，從而得以分離。第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月32第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法一、柱色譜法（一）吸附柱色譜法固定相：吸附劑硅膠硅膠的吸附活性與含水量有關(guān)。含水量越大，活性級數(shù)越大，吸附活性越低，吸附能力越弱。第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月33第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

硅膠呈微酸性，主要用于分離酸性和中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體、萜類等。氧化鋁吸附活性與其含水量密切相關(guān)，水分的增加能降低其吸附能力。中性氧化鋁用于分離酸性、中性和堿性化合物，如生物堿、揮發(fā)油、甾體、萜類及在酸堿中不穩(wěn)定的酯類、苷類等。

第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月34第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

聚酰胺

主要通過分子中的酰氨基與化合物質(zhì)子給予體形成氫鍵而對該物質(zhì)產(chǎn)生吸附，因形成氫鍵的能力不同，吸附能力也不同，從而使各化合物得以分離。主要用于酚類（含黃酮類、蒽醌類、鞣質(zhì)類等）、酸類、硝基類等物質(zhì)的分離。第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月35第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

大孔吸附樹脂：

主要通過范德華引力或產(chǎn)生氫鍵而吸附被分離物質(zhì)，選擇性則由其多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所決定。

主要用于水溶性化合物的分離及純化，如皂苷、其它苷類物質(zhì)等。

第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月36第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

流動相

吸附色譜中，流動相的洗脫作用實質(zhì)上是流動相分子與被分離組分分子競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程，極性強的流動相分子占據(jù)吸附活性中心的能力強，具有強的洗脫作用；而極性弱的流動相分子競爭占據(jù)吸附活性中心的能力弱，洗脫作用就弱。

第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月37第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

流動相的選擇必須同時兼顧被測物的性質(zhì)、吸附劑的活性和流動相的極性等三方面。一般原則是：若被分離組分極性較小，宜選用吸附活性較大的吸附劑和極性較小的洗脫液；反之，則應(yīng)選擇吸附活性小的吸附劑和極性較強的洗脫液。

第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月38第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

被測物質(zhì)的極性、吸附劑活性和流動相極性之間的關(guān)系示意圖

第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月39第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

（二）分配柱色譜法固定相由載體及涂漬或鍵合在載體表面的固定液組成。載體是一種惰性物質(zhì)，主要起負載或支撐固定液的作用。固定液正相色譜：強極性溶劑，如水、甲醇等。反相色譜：非極性或弱極性溶劑，如液體石蠟等。第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月40第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

流動相正相色譜：極性小于固定相的醇類、酮類、酯類、鹵代烷、苯或其混合物。反相色譜：水、稀醇等極性溶劑。應(yīng)用各類化合物的分離，特別是親水性物質(zhì)，如極性較大的酚類、糖類、氨基酸衍生物等。第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月41第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

（三）離子交換柱色譜法固定相離子交換樹脂交聯(lián)度：離子交換樹脂中所含交聯(lián)劑的量。用于衡量離子交換樹脂的選擇性，交聯(lián)度大，樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)眼小，選擇性好。交換容量：實驗條件下，每克干樹脂真正參加交換的活性基團數(shù)。用于衡量離子交換樹脂的交換能力，交換容量大，樹脂的交換能力強。第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月42第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

流動相

水為溶劑的緩沖溶液。應(yīng)用去離子水的制備，天然藥物化學(xué)成分的分離，各種有機酸、氨基酸的分離制備，抗生素的純制、去除干擾離子、測定某些鹽類的含量等。第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月43第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

（四）空間排阻柱色譜法固定相多孔性凝膠，常用葡聚糖凝膠。選擇凝膠時應(yīng)使試樣的相對分子量落入凝膠的相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)。流動相

一般水溶性試樣選擇水溶液為流動相，而非水溶性試樣則選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯等有機溶劑為流動相。第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月44第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

應(yīng)用

天然藥物化學(xué)和生物化學(xué)的研究，水溶性高分子化合物如蛋白制劑等的分析。

第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月45第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

二、平面色譜法（一）薄層色譜法薄層色譜法是將固定相（如：吸附劑）均勻地涂鋪在光潔的玻璃板、塑料板或金屬板上形成薄層，在薄層板上進行分離分析的方法。分離機制與吸附柱色譜的分離機制相似。第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月46第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

比移值與相對比移值

比移值（retardationfactor，Rf）：

L0原點溶劑前沿ABL1L2Rf的測量示意圖第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月47第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

Rf可用范圍是0.2～0.8，最佳范圍是0.3～0.5。

相對比移值（relativeretardationfactor，Rr）

Rr可以大于1，也可以小于1。第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月48第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法例題已知被測物質(zhì)A和參考物B在同一薄層板上進行色譜分析，展開后，溶劑前沿到原點的距離為18cm，A、B兩物質(zhì)斑點中心到原點的距離分別為12cm和9cm，請計算：（1）A物質(zhì)的比移值。（2）A、B兩物質(zhì)的相對比移值。

第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月49第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

吸附劑與展開劑

吸附劑（固定相）與吸附柱色譜法所用的吸附劑相似，其主要區(qū)別在于薄層色譜法所用的吸附劑顆粒更細小。

展開劑（流動相）

選擇：遵循“相似相溶”原則，極性大的組分選擇極性大的展開劑，反之亦然。

第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月50第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法混合展開劑：一般在混合溶劑中占比例較大的溶劑起著溶解物質(zhì)和分離的作用；而占比例小的溶劑則起著調(diào)整溶劑極性、改善Rf的作用。問題在苯-乙醇（9?1）展開劑中，您知道苯、乙醇的作用嗎？第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月51第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

操作方法

操作程序可分為制板、點樣、展開、斑點定位等。

定性和定量分析定性分析：利用Rf或Rr進行定性。

定量分析常用的定量方法有目視比色法、洗脫法和薄層掃描法。第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月52第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

目視比色法：一種半定量分析方法。洗脫法：將組分斑點全部取下，用適當?shù)娜軇┻M行洗脫，再選用適當?shù)姆椒ǎㄈ纾鹤贤夥止夤舛确ā晒夥止夤舛确ǖ龋┻M行定量測定。薄層掃描法：用薄層掃描儀對組分斑點進行掃描，直接測定斑點的含量。注意事項：色斑集中、無拖尾；選用對被測組分有較大溶解度的溶劑浸泡并多次洗脫；對不易洗脫的組分，可采用離心分離或濾過等方法進行定量洗脫。

第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月53第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

應(yīng)用適用于有機化合物的分離與鑒定，也可用于小量物質(zhì)的提純與精制。在藥學(xué)領(lǐng)域中，可用于測定藥品純度和檢查降解產(chǎn)物；判斷藥品合成反應(yīng)進行的程度、監(jiān)控反應(yīng)歷程；分離和測定天然藥物的有效成分。

第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月54第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法

（二）高效薄層色譜法與薄層掃描法簡介高效薄層色譜法高效薄層板一般為商品預(yù)制板，由顆粒直徑比經(jīng)典薄層板更細小、更均勻的化學(xué)鍵合相、硅膠、氧化鋁、纖維素等固定相，采用噴霧技術(shù)制成。薄層掃描法簡介基本原理

CS-910雙波長雙光束薄層掃描儀的基本光路圖

第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月55第四節(jié)經(jīng)典液相色譜法CS-910雙波長雙光束薄層掃描儀的基本光路示意圖

第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月56第