第09章 維生素類藥物的分析-3-2012

藥物分析學（第十四章）維生素類藥物的分析（3）本節(jié)教師：韓海（博士/副教授)暨南大學藥學院Tel-mail:thanhaik@QQ:560118562013.11.06維生素D的分析維生素D簡介維生素D為類甾醇衍生物，具有抗佝僂病作用。VD家族中最重要的是麥角骨化醇（VD2）和膽骨化醇(VD3)。其主要生理功能是促進鈣磷的吸收，有利于新骨的生成與鈣化。主要存在于肝、奶、蛋黃中。兒童缺乏VD患佝僂病成人缺乏VD患骨質疏松病。膽甾醇7-脫氫膽甾醇維生素D3維生素D2麥角甾醇甾醇衍生物結構及性質維生素D2、維生素D3

（ChP收錄）★[結構特點與分析方法的關系]1．開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應，可用于鑒別。2．手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。3．多烯：可進行紫外檢測,不穩(wěn)定.結構及性質性質：1.性狀:無色針晶或白色結晶狀粉末2.溶解性:脂溶性3.不穩(wěn)定性:易氧化,對酸也不穩(wěn)定.4.旋光性:具手性碳5.可發(fā)生甾類化合物的顯色反應6.紫外吸收:265nmE1%1cm（VitD2：460-490,VitD3：465-495）★鑒別試驗★

（一）顯色反應：1.醋酐-濃硫酸反應：D2:黃

紅

紫

綠。D3:黃紅

紫、藍綠綠2.三氯化銻反應:橙紅色，漸變粉紅

3.三氯化鐵反應:橙黃色鑒別試驗（二）維生素D的比旋度藥物溶劑濃度比旋度值維生素D2

無水乙醇40mg/ml+102.5°～+107.5°維生素D3

無水乙醇5mg/ml+105°～+112°注意事項應于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定，否則會有變旋光現(xiàn)象。鑒別試驗（三）其他鑒別方法TLC、HPLC、制備衍生物測熔點UV、IR★

（四）VitD2、VitD3區(qū)別反應：Kober反應：85%濃硫酸—乙醇顯色甾類化合物的顯色反應VitD2：紅色，

max=570nmVitD3：黃色，

max=495nm雜質檢查（一）麥角甾醇ChP規(guī)定VitD2中必須檢查項目試劑：洋地黃皂苷溶液混合放置18小時，不得發(fā)生渾濁或沉淀（二）前VitD（5，7—二烯甾醇）的光照產(chǎn)物（三）有關物質：NP-HPLC含量測定方法種類：化學法光譜法色譜法微生物法生化法—競爭蛋白結合法（特異性最高）中國藥典——正相高效液相色譜法維生素D的含量測定的高效液相色譜法（ChP方法簡介）方法提要：NP-HPLC(VitD2、VitD3均以本法測定)硅膠柱流動相：正己烷—正戊醇（997:3）檢測波長:254nm定量方法：內(nèi)標法，(測定維生素D的總量.)內(nèi)標物：鄰苯二甲酸二甲酯

該法分為三個方法:第一法：用于無維生素A醇及其它雜質的干擾的情況，直接進樣測定：1．系統(tǒng)適用性試驗：測定重復性和分離度。

維生素D3

、前維生素D3

、反式維生素D3

、速甾醇D3

（R>1.0)2．測定前維生素D折算維生素D的校正因子：f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）3．含量測定：用維生素D及前維生素D折算維生素D的總量.mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS

第二法：用于有雜質的干擾的情況，需要預處理：1．皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙醚、制備供試液A。2．凈化：供試液A經(jīng)液相色譜分離，準確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。3．含量測定：取供試液B按第一法測定。第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質的干擾的情況，預處理后還要處理：1．預處理后在經(jīng)提取分離制備供試液C。供試液C用于進樣測定：2．含量測定：在第一法的色譜條件下，交替精密進樣對照液和供試液C，按外標法定量。

維生素E的分析主要生理功能：

1.抗氧化作用：清除自由基保護膜結構。

2.促進血紅素的合成：能提高血紅素合成過程中的關鍵酶ALA合成酶和ALA脫水酶的活性OCH3COOR2R1R3生物效價右旋體：消旋體=1.4:10（天然品）（合成品）一、結構及性質★★[結構特點]:1．芳環(huán)：具弱紫外吸收，可用于鑒別。2．乙?；姆恿u基：水解后生成生育酚，可發(fā)生三氯化鐵反應和氧化還原反應，用于鑒別。分子中無親水基，不溶于水。酯鍵易水解

維生素E為苯丙二氫吡喃醇衍生物，苯環(huán)上有一個乙?；姆恿u基，又稱生育酚。α-異構體活性最強。一、結構及性質★[理化性質]:1.溶解性微黃色或黃色透明的粘稠液體，易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，不溶于水。2.水解性：在酸性或堿性溶液中，加熱可水解生成游離生育酚。3.易氧化性：維生素E水解后的產(chǎn)物，在有氧或其他氧化劑存在時，則進—被氧化生成醌，堿性條件下加熱則更易反應，應避光、避氧保存。4.弱紫外吸收:本品的無水乙醇溶液在284nm波長處測定吸收度時，其吸收系數(shù)E1%1cm為41.0—45.0。(0.1mg／mL溶液測定)（此性質可用于鑒別，但不能用于含量測定！）二、鑒別試驗★1.硝酸反應ChP，JP★[原理]:維生素E在硝酸酸性溶液中，加熱可水解生成生育酚，生育酚繼續(xù)被氧化成為鄰醌結構的生育紅。（橙紅色）強氧化劑生育酚HNO3（橙紅色）生育紅[方法]：取本品約30mg，加無水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在75℃加熱約15min，溶液應顯鮮紅色，逐步轉為橙紅色。[特點]：簡便、快速、呈色明顯★2.三氯化鐵反應:★[原理]:維生素E在堿性溶液中加熱水解生成游離生育酚，并被三氯化鐵氧化為對生育醌，同時生成亞鐵離子。后者與聯(lián)吡啶生成血紅色的配離子。生育酚[O]對-生育醌弱氧化劑血紅色★[方法]：取本品約10ml，加醇制氫氧化鉀試液2ml，煮沸5min，放冷，加水4ml與乙醚10ml，振搖、靜置使分層，取乙醚液2m1，加2，2’—聯(lián)吡啶的乙醇溶液(0.5→100)數(shù)滴和三氯化鐵的乙醇溶液(0.2→100)數(shù)滴，應顯血紅色。[討論]:1.)測定前必須水解維生素E,操作繁瑣2.)專屬性不高3.紫外光譜法本品的0.01％(W/V)無水乙醇溶液λmax=284nmλmin=254nm

=41.0～45.5可用于鑒別。4.薄層色譜法硅膠G板溶劑：氯仿展開劑：環(huán)己烷—乙醚（4:1）濃硫酸顯色，根據(jù)Rf值定性

★5.氣相色譜法:USP(24)ChP(2000)以保留時間定性6.紅外光譜法:JP(14)BP(2000)VitERf

=0.7三、雜質檢查1.酸度檢查目的:檢查維生素E制備過程中引入的游離醋酸.方法:ChP酸度檢查法.(教材P275)★

2.特殊雜質——游離生育酚的檢查ChP(2000)方法:硫酸鈰滴定法.[原理:]游離生育酚有還原性,可被硫酸鈰定量氧化.可以用硫酸鈰滴定法來控制游離生育酚的限量.[檢查方法]

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸鈰滴定液不得超過1.0m1。若硫酸鈰液濃度不是0.01000mol/L，則應重新計算硫酸鈰的消耗量??！[討論]1.酸性環(huán)境中進行,否則硫酸鈰滴定液會生成堿式鹽而影響測定。2.二苯胺的作用是作為指示劑,終點時溶液由亮黃色轉變?yōu)榛易仙?3.1mol的硫酸鈰相當于1/2mol的游離生育酚(215.4g);每1ml(0.01mol/L)的硫酸鈰滴定液相當于0.002154g游離生育酚.4.ChP規(guī)定的雜質限量為2.15%.維生素E的分析四、含量測定應該采用何種方法？根據(jù)化學性質：1.可被硫酸鈰定量氧化.——鈰量法2.三氯化鐵反應——生成的亞鐵離子作用形成有色結合物間接測定（三氯化鐵—2，2’—聯(lián)吡啶比色法）含量測定根據(jù)物理化學性質：1.紫外分光光度法:——不適用λmax=284nmE1%1cm=41.0—45.0<100

2.色譜法方法簡便快速，專屬性強，特別適用于多種維生素制劑中維生素E的測定。

3、熒光分光光度法★★氣相色譜法(ChP)六十年代起開始研究維生素E的氣相色譜法(GLC).GC特點選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強→衍生化易受樣品蒸氣壓限制氣相色譜法(GLC)測定維生素E的優(yōu)點

可分離維生素E、其異構體及雜質，可選擇性地測定維生素E

。適宜測定純度不高的維生素E及維生素E制劑。中國藥典測定維生素E及維生素E制劑均采用氣相色譜法。VitE測定的色譜條件載氣→N2★固定液→50%苯基—甲基硅酮（OV-17）或HP-1柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)★內(nèi)標→正三十二烷內(nèi)標法供試液（樣品+內(nèi)標）內(nèi)標物對照液（對照+內(nèi)標）是樣品中不存在的物質與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近系統(tǒng)適用性試驗：n≥500（按維生素E計算）

R≥2（維生素E與內(nèi)標物正三十二烷的分離度

）★定量法:內(nèi)標法加校正因子1KAA=內(nèi)對2KAA=內(nèi)樣實際工作中的計算方法本品含C31H52O3應為96.0~102.0%其他藥典方法：BP（2000）GC內(nèi)標正三十二烷R≥1.4USP（24）GC內(nèi)標十六酸十六醇酯R≥1.0JP（14）HPLC測定dl－α－生育酚[JP（14）中的維生素E]

外標法JP（15）RP-HPLC外標法簡介樣品、外標→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）流動相→甲醇-水（49：1）檢測波長→292nm（吸收峰肩峰）

R＞2.6RSD≤0.8%對樣對生育酚HHmW×=維生素E的熒光分光光度法（一）熒光反應法原理：維生素E的硝酸反應。利用硝酸將氧化為生育紅，再將這一產(chǎn)物和鄰苯二胺在冰醋酸中縮臺，縮臺物在紫外光照射下發(fā)生綠色熒光。以F—C定量。維生素E的熒光分光光度法二、新分析技術的應用——同步掃描直接（內(nèi)源）熒光法[原理]：維生素大多含有芳香環(huán)結構（大的共軛

鍵結構），本身具有較強的天然熒光，因此可以利用內(nèi)源熒光檢測維生素。如血液中維生素A345nm激發(fā)，490nm處測量。維生素E295nm激發(fā)，325nm處測量。直接295nm激發(fā)，325nm處測量。則溶劑Raman光譜嚴重干擾測定!(教材圖14-6)同步熒光掃描技術（可變角同步掃描技術）90年代Clark等人近年提出的新技術，可以減小了散射光的影響，改善由常規(guī)熒光掃描所無法分開的光譜重疊體系的分辨率。分類：1.“固定波長同步掃描熒光測定”——維生素E的熒光法使用2.“固定能量同步掃描熒光測定”

3.“變角同步掃描熒光測定”Stoke位移掃描過程中使激發(fā)波長（

ex）和發(fā)射波長（

em）彼此間保持固定的波長間隔

em-

ex=常數(shù)（本實驗中△

為40nm）定量依據(jù):FSL=2.3KCLI0XI0由Fex（

em-

）決定、X由Fem（

em）決定

FSL=2.3KCLI0X由Fex（

em-

）與Fem（

em）的乘積決定

在△

保持固定的情況下，同步熒光的信號強度便與待測物質的濃度成正比

實驗確定△的原則:1.能消除或減小溶劑Raman光干擾2.兼顧方法靈敏度3.一般推薦選擇等于（或大略于）Stoke位移的△

.優(yōu)點:有望獲得同步熒光信號最強、半高寬度最小的單峰同步熒光光譜。

維生素類藥物的分析方法總結★[結構特點與分析方法的關系歸納總結]要求記住六種維生素藥物的結構式特征本類藥物重要結構特點及反應比較1．共軛多烯結構：具有紫外吸收，（1）可采用紫外吸收光譜法進行鑒別，VitA、B1、C、D、E（2）可采用紫外分光光度法進行含量測定。VitA、B1、C、D本類藥物重要結構特點及反應比較2.旋光性：VitC、D具手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。VitC

：＋20.50～＋21.50VitD2：+102.5°～+107.5°VitD3：+105°～+112°

VitE為消旋體VitA、B1無旋光性本類藥物重要結構特點及反應比較3.以三氯化銻生成絡合物反應：維生素A、D與三氯化銻生成絡合物。維生素A：藍色，漸變紫紅維生素D：即橙紅色，漸變粉紅其他維生素無此反應

還原性引起的反應：4.還原性：

VitA、C、D、E都具有還原性,易被氧化.還原性引起的反應：（1）.三氯化鐵反應:VitD、EVitD:橙黃色VitE:水解后以三氯化鐵、2，2-聯(lián)吡啶反應：血紅色還原性引起的反應：（2）硝酸反應：VitE溶液應顯鮮紅色，逐步轉為橙紅色。（3）硝酸銀反應：VitC黑色沉淀（4）2，6—二氯靛酚反應：VitC顏色消失VitC、D、B1的特征反應VitC類似糖類物質：發(fā)生糖類的糠醛縮合反應以三氯醋酸、吡咯50℃產(chǎn)生藍色

VitD類似甾體類物質：發(fā)生甾體類的Liberman反應、Kober反應Liberman反應：醋酐-濃硫酸試劑D2：黃紅紫綠D3：黃紅紫藍綠綠VitC、D、B1的特征反應Kober反應：85%濃硫酸—乙醇顯色VitD2：紅色，

max=570nmVitD3：黃色，

max=495nmVitB1類似生物堿類物質：發(fā)生生物堿試劑沉淀反應碘化汞鉀淡黃色沉淀碘紅色沉淀VitC、D、B1的特征反應硅鎢酸白色沉淀苦酮酸扇形白色結晶

VitB1為硫雜環(huán)類物質：1.發(fā)生硫色素反應

:鐵氰化鉀試液強烈的藍色熒光，酸化后熒光消失.2.發(fā)生硝酸鉛反應

:氫氧化鈉、硝酸鉛黑色沉淀

★★ChP版規(guī)定的含量測定方法(一)維生素A★★紫外分光光度法——三點校正法（第一法、第二法）中國藥典收載的維生素A膠丸、維生素AD滴劑、維生素AD膠丸等均采用三點校正法測定?！铩顲hP規(guī)定的含量測定方法(二)維生素D正相高效液相色譜法，定量方法為內(nèi)標法，內(nèi)標物為鄰苯二甲酸二甲酯

用維生素D及前維生素D折算維生素D的總量.中國藥典收載的維生素D及其制劑，均用本法測定?！铩顲hP規(guī)定的含量測定方法★★

（三）維生素E氣相色譜法(GLC)定量方法為內(nèi)標法，內(nèi)標物為正三十二烷。中國藥典收載的維生素E及其制劑，均用本法測定。★★ChP規(guī)定的含量測定方法★★

（四）維生素C碘量法，碘滴定液滴定1m1的碘滴定液(0.05mol/L)相當于8.806mg的C6H8O6中國藥典中維生素C原料、維生素C片、維生素C泡騰片、維生素C注射液、維生素C顆粒劑等進行含量測定均選用此方法★★ChP規(guī)定的含量測定方法★★

（五）維生素B1原料藥與制劑測定方法不同！原料藥測定：非水溶液滴定法高氯酸滴定液滴定，高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定度為16.86mg/ml。制劑測定：紫外分光光度法用鹽酸溶液（91000）將維生素B1片粉中的維生素B1溶出，經(jīng)過濾、稀釋后于246nm測定吸收度，計算含量。1．在三氯醋酸或鹽酸存在下，經(jīng)水解、脫羧、失水后，加入吡咯即產(chǎn)生藍色產(chǎn)物的藥物應是

A.氯氮卓

B.維生素AC.普魯卡因

D.鹽酸嗎啡

E.維生素C2、中國藥典采用以下何法測定維生素E含量

A.酸堿滴定法

B.氧化還原法

C.紫外分光光度法

D.氣相色譜法

E.非水滴定法3、中國藥典采用氣相色譜法測定維生素E含量，內(nèi)標物質為

A.正二十二烷

B.正二十六烷

C.正三十烷

D.正三十二烷

E.正三十六烷4、維生素C的鑒別反應，可以采用的試劑有

A.堿性酒石酸銅

B.硝酸銀

C.碘化鉍鉀

D.2、6-二氯靛酚

E.三氯醋酸和吡咯5、測定維生素C注射液的含量時，在操作過程中要加入丙酮，這是為了

A.保持維