DB36-T 1902-2023 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 嗜肺巴斯德桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法

65.020.30CCS

B

44

DB36江 西 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB

36/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嗜肺巴斯德桿菌熒光定量

PCR檢測(cè)方法Laboratory

animal—

quantitative

method

for

ofpasturella

江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB36/T

1902—2023前 言

..............................................................................

II1

范圍

..............................................................................

12

規(guī)范性引用文件

....................................................................

13

術(shù)語和定義

........................................................................

14

縮略語

............................................................................

25

設(shè)備和材料

........................................................................

26

試劑

..............................................................................

27

檢測(cè)流程

..........................................................................

28

結(jié)果判定

..........................................................................

4附錄

溶液配制方法....................................................

5附錄

熒光定量

的引物與探針........................................

7附錄

熒光定量

檢測(cè)方法............................................

8參

考

文

獻(xiàn)

..........................................................................

9IDB36/T

1902—2023 本文件按照GB/T

1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江西省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：江西省職業(yè)病防治研究院。本文件主要起草人：熊莉娟、周銀平、張陸兵、肖芳平、萬筱榮、賈菠、劉歡、羅勇兵、李建昌、周劍。IIDB36/T

1902—2023實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

PCR

檢測(cè)方法1 范圍本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嗜肺巴斯德桿菌熒光定量PCR劑、檢測(cè)流程和結(jié)果判定等內(nèi)容。的檢測(cè)參照?qǐng)?zhí)行。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

微生物、寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法GB

實(shí)驗(yàn)室

生物安全通用要求GB/T

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1嗜肺巴斯德桿菌

pneumotropica是

Jawetz

型和

型。3.2熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

real-time

quantitative

polymerase

chain

在常規(guī)

PCR

的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物和一條特異性探針，探針兩端分別標(biāo)記PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq

酶的

5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，淬滅作用消失，熒光信號(hào)產(chǎn)生并被檢測(cè)儀器接受。隨著

PCR

反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR

產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)核酸模板進(jìn)行檢測(cè)。3.31DB36/T

1902—2023Ct

值

cycle

value熒光定量PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:

脫氧核糖核酸(

acid)PBS:

磷酸鹽緩沖液(

buffered

saline)Taq

Taq

DNA聚合酶(Taq

DNA

)5 設(shè)備和材料5.1 設(shè)備

PCR

4

℃、

℃、

℃

μL、2

、20

μL~200

、100

000

）。5.2 材料滅菌離心管（

、1.5

mL、5

mL、15

mL）、滅菌吸頭、滅菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)管、剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。6 試劑6.1

本文件所用試劑均為分析純或生化試劑，試驗(yàn)用水符合

6682

的要求。6.2

滅菌

PBS

A

中

A.1）。6.3

乙酸鉀溶液（配制方法見附錄

A

中

）。6.4

裂解液（配制方法見附錄

A

中

A.6）。6.5

蛋白酶

K

溶液（配制方法見附錄

A

中

A.7）。6.6

Tris-飽和酚（pH>7.8）。6.7

氯仿/異戊醇（24∶1

24∶1

的比例配制。6.8

TE

緩沖液（配制方法見附錄

A

中

A.8）。6.9

70%

A

中

A.9）。6.10

無水乙醇：

℃預(yù)冷。6.11

細(xì)菌基因組

DNA

抽提試劑盒：商品化試劑盒。6.12

熒光定量

PCR

試劑盒：商品化熒光定量

PCR

試劑盒。6.13

引物和探針序列（見附錄

B

中

B.1）。6.14

陽性對(duì)照（嗜肺巴斯德桿菌

DNA）。6.15

陰性對(duì)照（不含嗜肺巴斯德桿菌的

DNA）。7 檢測(cè)流程7.1 生物安全要求2DB36/T

1902—2023實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB

19489GB/T

19495.2中的要求執(zhí)行。采樣參照GB

14922中的要求執(zhí)行。7.2 樣品采集7.2.1 臟器組織按照GB/T

取待檢樣本2.0

g于無菌15

離心管中，密封、編號(hào)，待檢。7.2.2 嗜肺巴斯德桿菌分離培養(yǎng)物可以直接使用GB/T

14926.12分離培養(yǎng)法中嗜肺巴斯德桿菌血瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物作為檢測(cè)樣本，用接種環(huán)刮取2個(gè)菌落裝于無菌5

離心管中，密封、編號(hào)，待檢。7.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料取1.0

g實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料置于

離心管中，密封、編號(hào)，待檢。7.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15

離心管中，密封、編號(hào)，待檢。7.3 樣品處理7.3.1 臟器組織在生物安全柜內(nèi)用滅菌剪刀將臟器組織剪碎后，加入4

滅菌PBS，使用電動(dòng)勻漿器充分勻漿2，然后將組織懸液在4

℃，3

000

g離心10

，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5

離心管中，編號(hào)備用。7.3.2 嗜肺巴斯德桿菌分離培養(yǎng)物向裝有樣品的離心管中加入4

滅菌PBS，振蕩至菌體徹底懸浮，編號(hào)備用。7.3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備向裝有樣品的離心管中加入4

mL滅菌PBS(墊料或棉拭子需全部浸泡于液體中)。密封后浸泡，充分混勻，靜置30

，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5

離心管中，編號(hào)備用。7.4 樣本存放采集或處理的樣本在2

℃～8

℃條件下保存應(yīng)不超過24

h

℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。7.5 樣本

提取7.5.1樣本

DNA

在實(shí)驗(yàn)室中提取步驟如下：a) 取

350

已處理好的樣品加入

的蛋白酶

K

℃水浴

2

h

或

37

℃消化過夜；b) 向消化后的裂解液中加入

70

乙酸鉀溶液，混勻冰浴

，4

℃，12000

g

離心

，取上清液轉(zhuǎn)移至新的

1.5

離心管；3DB36/T

1902—2023c) 加入等體積的

Tris-飽和酚，緩慢顛倒混勻

10

，4

℃，12000

g

離心

10

；d)

倍體積的

Tris-飽和酚和

0.5

倍體積的氯仿/24∶1），12000

g

離心

10

；e) 取上清液至新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），12000

g

離心

10

；f)取上清液至新的離心管中，加入

2

倍體積

℃預(yù)冷的無水乙醇，輕輕搖晃至絮狀沉淀析出，12000

g

離心

10

，棄上清；g)加入

70%乙醇沖洗沉淀表面及管壁，12000

g

離心

3

，吸去上清液；h) 室溫下放置

2

100

TE

緩沖液溶解

DNA

沉淀，即可用于檢測(cè)或

℃保存?zhèn)溆谩?.5.2

樣本

DNA

也可采用同等效果的商品化試劑盒提取，提取按照試劑盒的使用說明書操作。7.6熒光定量

熒光定量PCR檢測(cè)方法應(yīng)符合附錄C。8 結(jié)果判定8.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照

Ct

值≤35，且出現(xiàn)對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線。陰性對(duì)照及空白對(duì)照無

Ct

值，且無對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線。二者均成立才可判定試驗(yàn)成立。8.2 檢測(cè)結(jié)果判定符合Ct值≤35Ct值且無對(duì)數(shù)35＜Ct值≤40Ct值仍然數(shù)增長期，則判定陽性；否則判定陰性。4DB36/T

1902—2023AA附 錄 A（規(guī)范性附錄）溶液配制方法A.1 滅菌PBS溶液NaCl）8.00

g）0.20

gPO）0.24

gNaHPO·O）3.65

g

800

至

7.2～7.4

1

。在

103.4

（

條件下滅菌

20

，冷卻備用。A.20.5

mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH

8.0）稱取18.6

g乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na），加入80

水中，充分?jǐn)嚢瑁脷溲趸c（）顆粒調(diào)至，加水定容至100

。在103.4

（

℃)條件下滅菌20

。A.3 1

mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(pH

8.0)稱取

121.1

g

Tris)溶解于

800

HCl

至

8.0,加水定容至1

000

。在

103.4

（

℃）條件下滅菌

A.45

mol/L氯化鈉溶液稱取

29.22

g

NaCl

100

103.4

℃）條件下滅菌

20

。A.5 裂解液在約

mL

水中，依次加入

10

mL

0.5

乙二銨四乙酸二鈉溶液、20

1

mol/L

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液、

5

氯化鈉溶液。另稱取

10g

十二烷基硫酸鈉（CHOSNa，SDS），混合后加熱至完全溶解后冷卻至室溫，用水定容至

1

000

，室溫保存?zhèn)溆?。A.6蛋白酶K溶液將

20

蛋白酶

K（＞

10

。于

℃保存?zhèn)溆谩.7乙酸鉀溶液（pH

4.8）稱取

29.43

g

溶于

HAc

至

4.8,加水定容至

100

。在103.4kPa

蒸汽壓（121℃）條件下滅菌

20

。5DB36/T

1902—2023A.870%乙醇取無水乙醇，加入蒸餾水，充分混勻后備用。A.9 TE緩沖液（pH

在約

水中，依次加入

10

1

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液和

2

0.5

乙二銨HCl）調(diào)

至

1000mL。在

蒸汽壓（121℃）條件下滅菌

。6DB36/T

1902—2023BB附 錄 B（規(guī)范性附錄）熒光定量

B.1 引物和探針序列正向引物 5'-CGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGT-3'反向引物探針

Jawetz 探針

注：探針可選用具有與和BHQ-1熒光基團(tuán)相同效果的其他熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。7反應(yīng)組分用量終濃度Probe

qPCR

Mix（210μL1×正向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L反向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L探針（10μmol/L）0.6μL300nmol/LDNA

模板1μL-滅菌去離子水6.8μL-總體積20μL-注：反應(yīng)體系可根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。步驟溫度時(shí)間采集熒光信號(hào)循環(huán)數(shù)預(yù)變性95℃-1變性95℃15s-40退火,延伸57℃60s是注：反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。DB36/T

1902—2023CC附 錄 C（規(guī)范性附錄）熒光定量

C.1 熒光定量

PCR

反應(yīng)體系DNA

作陽性對(duì)照、不含嗜肺巴斯德桿菌的

DNA

作陰性對(duì)照、以滅菌去離子水作空白對(duì)照。表

C.1

反應(yīng)體系C.2 熒光定量

PCR

反應(yīng)條件表

C.2 熒光定量

反應(yīng)條件8DB36/T

1902—2023參

考 文 獻(xiàn)[1]

Stojek

NM,

Dutkiewicz

J.

Studies

on

the

occurrence

of

Gram-negative

bacteria

in

ticks:

Ixodesricinus

as

a

potential

vector

of

Pasteurella.

Ann

Agric

Environ

Med.

2004,11(2):319-22.[2]

胡小琦,彭煥文,田巍威.人感染嗜肺巴斯德桿菌病例報(bào)告[J].寄生蟲病與感染性疾病,2017,15(01):52.[3]

Benga

L,Benten

of

a

PCR

based

on

16S-23S internaltranscribed spacer detection of rodentPasteurellaceae[J].J

Methods,2013,95(2):256-261.[4]

Gautier

AL,

Dubois

D,