SNT 2518-2010貝類食品中食源性病毒檢測(cè)方法納米磁珠-基因芯片法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)貝類食品中食源性病毒檢測(cè)方法納米磁珠-基因芯片法2010-03-02發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局ISN/T2518—2010本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B和附錄C為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局、博奧生物有限公司暨生物芯片北京國(guó)家工程研究中心、北京金納信生物有限公司、天津生物芯片有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1SN/T2518—2010貝類食品中食源性病毒檢測(cè)方法納米磁珠-基因芯片法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類中甲肝病毒、GI型和GⅡ型諾如病毒、A群輪狀病毒和星狀病毒的納米磁珠-基因芯片檢測(cè)方法。中毒樣品中上述5種病毒的檢測(cè)可參照使用。2規(guī)范性引用文件GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3.1術(shù)語(yǔ)和定義基因芯片genechip生物芯片技術(shù)是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、甲肝病毒屬中只有人甲型肝炎病毒一個(gè)成員，簡(jiǎn)稱甲肝病毒。甲肝病毒粒子的直徑約27nm,諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒直徑約為polyA尾。諾如病毒共可分為5個(gè)型，其中感染人的主要是GI型和GⅡ型。2股正鏈RNA,長(zhǎng)6.8kb,3’端有polyA尾。3.2縮略語(yǔ)bpbasepairDEPCdiethylpyrocarbonatePEGpolyethyleneglycol聚乙二醇。檢測(cè)5種食源性致病病毒。5試劑GB/T6682中一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。5.2勻漿緩沖液1:見(jiàn)附錄A.1.1。5.3勻漿緩沖液2:見(jiàn)附錄A.1.2。5.6引物和探針：5種病毒基因芯片檢測(cè)所用引物核酸序列見(jiàn)表1,探針核酸序列見(jiàn)表2;根據(jù)表1的表15種病毒RT-PCR引物名稱和序列病毒名稱引物(5’-3’)產(chǎn)物大小/bp甲肝病毒TGTGCTATGGTTCCTGGTGACCCAATCGAATCTGAAGCAT3表1(續(xù))病毒名稱引物(53-3’)產(chǎn)物大小/bp星狀病毒HAsV-FCATTGTTTGTTGTCATACTAACHAsV-RACATGTGCTGCTGTTACTAT諾如病毒GI型GI-SKFCTGCCCGAATTYGTAAATGAGI-SKRCCAACCCARCCATTRTACA諾如病毒GⅡ型GⅡ-SKFCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAGGⅡ-SKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACATA群輪狀病毒RotavirnsAFGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGGRotavirusARGATCCTGTTGGCCATCC注：諾如病毒I型、諾如病毒Ⅱ型、星狀病毒、甲肝病毒負(fù)鏈引物的5’端用TAMRA標(biāo)記；輪狀病毒正鏈引物的5’端用TAMRA標(biāo)記。表25種病毒特異性探針核苷酸序列病毒名稱探針名稱探針序列甲肝病毒HAVNH2-TITTTTTTTTTTTTTCATTGGAACAGGAACTTCAGCG星狀病毒HaslNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATCCGTGATGTTAATGGHas2NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATCCGTGATGCTAATGGHas3NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATACGTGATGCTAATGGNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGTAAATGATGATGGCGTCTAANH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGGGCGATCGCAATCTGGCTRotNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGTGGTATATTCAATACCATAC芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照NH2-TTTTTTTTTTTTTTTCTCATGCCCATGCCGATGC5.11RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：SuperScriptⅢFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen5.16溴化乙錠溶液(10pg/μL):見(jiàn)附錄A.1.5.17含0.5pg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠：見(jiàn)附錄A.1.7。5.18磷酸鹽緩沖液(PhosphatebufferedsalinePBS):見(jiàn)附錄A.1.8。1)給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)使用者，并不表示只認(rèn)可該產(chǎn)品。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用等效產(chǎn)品。45.20洗液I:2×SSC,0.2%SDS。5.23三氯甲烷。6儀器與設(shè)備6.106.116.126.136.156.186.216.22恒溫空氣浴振蕩器：37℃±1℃,200r/min;42℃±1℃,90r/min。電泳儀。高速冷凍離心機(jī)：4℃,10000g。7實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室設(shè)施應(yīng)達(dá)到SN/T1193實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求。8檢測(cè)流程基因芯片檢驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。5SN/T2518—2010 圖1基因芯片檢驗(yàn)流程圖9制取樣方法9.1樣品的運(yùn)輸與保存儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中保持樣品溫度在0℃~5℃。實(shí)驗(yàn)室接到樣品后應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)。如暫時(shí)不能9.2取樣首先用滅菌蒸餾水將貝殼表面的污泥清洗干凈，打開(kāi)貝殼后，倒掉腔內(nèi)的液體，使用滅菌消毒的剪刀和鑷子取貝類消化腺組織5g。GI型、GⅡ型和甲肝病毒RNA時(shí)，加入勻漿緩沖液2。充分勻漿150s,37℃溫育30min或室溫下200r/min,振蕩39min;4℃,106000g,離心1qmin。注：輪狀病毒和星狀病毒RNA的提取可以采用本方法10.1.1取9.3所得的上清液1m上轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，加入0.14mL16%PEG8000溶液(PEG終濃度為2%),顛倒5次混勻。冰上放置至少1h,4℃,10l?0og,離心10min,棄上清液，保留沉淀。下放置5min～15min,每隔1min～2min,顛倒混勻幾次。10.1.4將離心管放置于磁力架上，吸附納米磁珠1min～5min,棄上清液。病毒RNA,立即置于冰上冷卻1min,4℃,10000g離心5min,將含有病毒RNA的上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNase的1.5mL離心管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。該方法提取的病毒RNA無(wú)需進(jìn)一步純化可以直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。10.2.1將9.3中的上清液全部轉(zhuǎn)移到無(wú)RNase的50mL離心管中(可以分裝于2個(gè)50mL離心管),加入等體積16%的PEG8000溶液(PEG終濃度為8%),上下顛倒離心管以充分混勻。將離心管置于6旋混勻1min,室溫放置5min。10.2.44℃,10000g離心5min,小心吸取上清液至一無(wú)RNase的10mL離心管中。加入0.5倍體注：按照Dynabeads①Oligo(dT)zs使用說(shuō)明進(jìn)行RNA純化。10.3.1將10.2.6所得的RNA溶液置于65℃溫育2min,立即置于冰上。10.3.2溫育RNA溶液同時(shí)，轉(zhuǎn)移50μL已充分重懸的DynabeadsOligo(dT)zs至1.5mL無(wú)RNase10.3.5將10.3.1所得RNA溶液全部轉(zhuǎn)移至10.3.4的離心管中，輕柔混合，使磁珠與RNA溶液充分混勻，室溫放置3min～5min。將離心管置于磁力架上1mi清澄清后立即將上清液(洗脫下來(lái)的RNA)轉(zhuǎn)移至一干凈的無(wú)RNase的1.5mL離心管中。制備好的11.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件將貝類樣品中提取的5種病毒RNA混合均勻后同時(shí)進(jìn)行針對(duì)5種病毒的逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見(jiàn)表3。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置兩個(gè)平行。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)表3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件反應(yīng)液組成加樣量/pL逆轉(zhuǎn)錄混合引物(10μmol/L)1隨機(jī)引物2dNTP(10mmol/L)16混勻，65℃加熱5min,冰浴5min緩沖液(10×)247SN/T2518—2010反應(yīng)液組成加樣量/μL2RNaseOUT(40U/μL)1反轉(zhuǎn)錄酶111.2多重PCR反應(yīng)體系11.2.1甲肝病毒與星狀病毒多重PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表4。表4甲肝病毒與星狀病毒多重PCR反應(yīng)體系加樣量/μLPCR緩沖液(10×)22HAV-F(未標(biāo)記5pmol/L)和HAsV-F(未標(biāo)記5μmol/L)各0.23LA-TagE(5U/μL)水11.2.2諾如病毒GI型、GⅡ型和輪狀病毒多重PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表5。加樣量/μLPCR緩沖液(10×)22dNTP(10mmol/L)GI-SKF(未標(biāo)記5μmol/L),GⅡ-SKF(未標(biāo)記5μmol/L)和RotavirusAF(熒光標(biāo)記40μmol/L)RotavirusAF0.5,其余各0.2GI-SKR(熒光標(biāo)記40μmol/L),GⅡ-SKR(熒光標(biāo)記40μmol/L)和RotavirusA R(未標(biāo)記5μmol/L)RotavirusAR0.2,其余各0.53LA-TagE(5U/μL)水11.2.3PCR反應(yīng)參數(shù)如下，11.2.4PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(根據(jù)需要進(jìn)行)后進(jìn)行芯片雜交。將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制溴化乙錠含量為0.5pg/mL的1.5%瓊脂糖凝膠。取15μLPCR產(chǎn)物，加1.5μL上樣緩沖液點(diǎn)樣，在瓊脂糖凝膠的兩邊或中間位置點(diǎn)樣83V/cm～5V/cm,當(dāng)電泳指示劑溴酚藍(lán)移動(dòng)到凝膠邊緣時(shí)關(guān)閉電源，電泳結(jié)果檢測(cè)采用凝膠成像12.1芯片雜交體系將11.2.1和11.2.2所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行等體積混合。按表6配制雜交液，充分混勻，3000g離心加樣量/pL終濃度甲酰胺50×Denhardt's-總體積—-12.2芯片雜交12.2.1PCR產(chǎn)物變性將配制好的12.1的雜交體系在95℃,變性了min,立即置于冰上，冰浴1min。12.2.2雜交12.2.3洗片洗4min;最后用42℃預(yù)熱好清水清洗一次，清洗后的芯片放在50mL錐形離心管中(標(biāo)簽紙端朝下)12.2.4芯片掃描及結(jié)果判讀13結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)13.1信號(hào)值≥背景信號(hào)平均值+4×背景信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差，且信號(hào)值≥陰性對(duì)照信號(hào)平均值+4×陰性13.2背景信號(hào)平均值+2×背景信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差<信號(hào)值<背景信號(hào)平均值+4×背景信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差，9且陰性對(duì)照信號(hào)平均值+2×陰性對(duì)照信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差<信號(hào)值<陰性對(duì)照信號(hào)平均值+4×陰性對(duì)照信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差，重新進(jìn)行雜交，雜交結(jié)果與前一次一致，報(bào)告陽(yáng)性；雜交結(jié)果與陰性結(jié)果一致，報(bào)告陰性13.3信號(hào)值≤背景信號(hào)平均值+2×背景信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差，且信號(hào)值≤陰性對(duì)照信號(hào)平均值+2×陰性對(duì)照信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)差，探針雜交結(jié)果為陰性。14.1若芯片檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為未檢出相應(yīng)的病毒。14.2若芯片檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為檢出相應(yīng)的病毒。15安全措施為了保護(hù)試驗(yàn)室人員的安全，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)小心處置。并按GB19489中有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。SN/T2518—2010(規(guī)范性附錄)溶液的配制與容器的處理A.1溶液的配制氯化鈉去離子水5mol/L氫氧化鈉溶液800mL調(diào)pH9.6加去離子水至1000mL,加DEPC至終濃度為0.05%,37℃溫育過(guò)夜；121℃,15min滅菌。甘氨酸氯化鈉去離子水5mol/L氫氧化鈉溶液加去離子水至1000mL,加800mLDEPC至終濃度為0.05%,37℃溫育過(guò)夜；121℃,15min滅菌。加雙蒸水至500mL,加DEPC至終濃度為0.05%,37℃溫育過(guò)夜；121℃,15min滅菌。去離子水1000mL,加0.05%DEPC,37℃溫育過(guò)夜，121℃,15min滅菌；或直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)RNase超羥基甲基氨基甲烷(Tris)242冰乙酸57.1mL加雙蒸水至1000mL,121℃,15min滅菌備用。A.1.6溴化乙錠(EB)溶液溴化乙錠10mg滅菌雙蒸水20mL將溴化乙錠充分溶解于雙蒸水中，分裝于1.5mL離心管中，避光保存。A.1.71.5%瓊脂糖凝膠的配制混合后加熱完全熔化，待冷至50℃~60℃時(shí)，加溴化乙錠(EB)溶液2μL,輕輕晃動(dòng)搖勻，避免產(chǎn)氯化鈉7.650g無(wú)水磷酸氫二鈉0.724