SN-T 1166-2010水泡性口炎檢疫技術(shù)規(guī)范

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)代替SN/T1166.1—2002,SN/T1166.2—2002,SN/T水泡性口炎檢疫技術(shù)規(guī)范2010-11-01發(fā)布2011-05-01實施本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009.給出的規(guī)則起草。性口炎微量血清中和試驗操作規(guī)程》和SN/T1166.3—2006《水泡性口炎逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作——增加了水泡性口炎的病毒分離及鑒定；——增加了熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；——增加了競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國云南出人境檢驗檢本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：水泡性口炎檢疫技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物水泡性口炎的病毒分離及鑒定、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物水泡性口炎的檢驗檢疫。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是任日期的引用文體，僅注日期的版本適用于本文GB/T18088出人境動物檢疫采樣BHK-21:倉鼠腎細(xì)胞BLP:乳糖蛋白胨緩沖肉湯CPE:致細(xì)胞病變作用Ck值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信達(dá)到設(shè)起的刷值時所經(jīng)歷的循環(huán)或McAb;單克隆抗體PI:抑制百分比TCID:半數(shù)組織培養(yǎng)感染量Vero;非洲綠猴腎細(xì)胞VSV-IND:水泡性口炎病毒印地安那型VSV-NJ:水泡性口炎病毒新澤西型4.1病毒分離4.1.1樣品的采集：按GB/T18088進(jìn)行。主要采集動物口、蹄冠上或乳頭上的水泡上皮組織。采集后立即冷藏送檢或置碳酸緩沖甘油(配方見附錄A)中低溫保藏。采集到的水泡液置滅菌瓶中，冷藏送檢或低溫保藏。若從凍肉中采樣，可采淋巴結(jié)或組織；采集的精液樣品應(yīng)不少于1mL,凍精樣品每頭每批次取樣3管～5管；無癥狀或無水泡的活動物采集抗凝全血，胚胎及其沖洗液。2制見附錄A)配制成20%的懸液。精液用乳糖蛋白胨緩沖肉湯(BLP,配制見附錄A)作1:5稀釋后，經(jīng)沖洗液無需處理，全血用BLP作1:5稀釋后，直接用于病毒的分離或鑒定。4.1.3接種細(xì)胞：澄清組織懸液或水泡液與抗生素(含青霉素2000IU/mL、鏈霉素2000μg/mL)4℃作用30min,接種于BHK-21或Vero細(xì)胞單層，37℃.5%二氧化碳培養(yǎng)箱吸附1h,棄去接種物采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行病毒分離物的鑒定。接種后2d～3d5.1:1水泡性口炎病毒標(biāo)準(zhǔn)株新澤西型(NJ)和印第安那型(IND)標(biāo)準(zhǔn)病毒株。5.1.3逆轉(zhuǎn)錄酶AMV5.1.4RNA抑制劑(RNasin)5.1.6引物半套式引物分別根據(jù)NJ株和IND株擴增區(qū)的堿基差別設(shè)計。外側(cè)引物I(P1):5’AAGGCTCTCTGTTTCCGGATCTGG3';外側(cè)引物Ⅱ(P2):5'TGATTCAATATAATTATTTTGGGAC3’;NJ半套式引物(P3):5'TGTTCTGGTGTGCAAACCAGGTATC3';IND半套式引物5.1.6.2用DEPC水將引物配制成濃度為25pmol/μL。5.3.1“被檢樣品的采集和處理檢或置緩沖甘油(用0.01mol/LpH7.2的PBS配制的50%的甘油溶液)中低溫保藏；采集到的水泡液5.3.1.2被檢樣品的處理：將采集到的上皮、淋巴結(jié)或組織樣品，經(jīng)研磨后用0.01mol/LpH7.2的PBS配制成20%的懸液。全血、胚胎及其沖洗液、細(xì)胞培養(yǎng)物無需處理；取450μL樣品懸液放入?5.3.2.1陽性對照樣品制備：將水泡性口炎病毒NJ型和IND型分別接種BHK37℃吸附1h后加入維持液，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，逐日觀察。待CPE達(dá)75%以上，凍融氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3d,凍融兩次，收獲細(xì)胞懸液，分裝成1mL小瓶，置-70℃保存?zhèn)溆?；或采集相同動物的組織樣品作為陰性對照樣品。5.3.2.3對照樣品的處理：取450μL陽性和陰性對照樣品細(xì)胞懸液放入1.5mL的離心管，再加入對照，加入3倍體積Trizol,振蕩混合20s,靜置5min。5.3.3.2加入200μL三氯甲烷，振蕩混合20s,靜置5min;4℃12000r/min離心15min,取上清液5.3.3.34℃12000r/min離心15min,輕輕棄上清液，加1mLDEPC水配制的75%乙醇。5.3.3.5RNA提取也可采用等效的商品化病毒RNA·提取試劑盒制備RNA。10×Tag酶緩沖液氯化鎂(MgCl?)(25mmol/L)dNTPs(2.5mmol/L)引物P1Tag酶(5U)cDNA模板4pL將PCR反應(yīng)管置于PCR擴增儀。94℃5min;94℃45s、55℃45s、72℃30s,40次循環(huán)，然后用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖(含0.5μg/mLEB)平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將8μL樣品和2μL樣品緩沖液混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)時停止。在紫外燈下觀察有無227hp的DNA片段拉增產(chǎn)物條帶泳后能看到227bp的DNA帶，只是要求進(jìn)行定型，則需將產(chǎn)物按1:1000稀釋后，取5μL做模板。(PCR產(chǎn)物)5μL,Tag酶(5U)1μL,NTPs(2.5·mmol/L)2μL,引物P21μL,引物P35.3.7.4如同5.3.6,用TBE包泳緩沖腋配制2%的瓊脂糖(含0.5μg/mLEB)平板進(jìn)行電泳檢測。安那型(IND)病毒株的細(xì)胞懸液作為陽性對照，用正常的BHK-21或Vero細(xì)胞懸5.4:1PCR后陽性對照會出現(xiàn)一條227bp的DNA片段。陰性對照沒有該核酸帶。5.4.3待測樣品PCR擴增后，如能在相應(yīng)227bpDNA位置上有帶，即可作出定性。半套式PCR后5.4.4必要時對擴增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，參考序列參見附錄B。6.1.2高速臺式冷凍離心機(離心速度12000r/min以上)。56.1.3臺式離心機(離心速度3000r/min)。TAATCAGCCGGGTATTC-3’ACGAGGATC-3’(TAMAR)。同5.3.1。同5.3.3。分N(N=U+2+1),其中U為被檢樣品數(shù)、2內(nèi)剛性對照數(shù)、表反應(yīng)體系混合液配制每管用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL)1N×1dNTPs(每種均為10mmol/L)5N×5RNAsin(40U/μL)1N×1TaqDNA聚合酶(5U/μL)N×0.5反轉(zhuǎn)錄和PCR緩沖液(5×)N×106N×6上游引物(15μmol/L)1N×1下游引物(15μmol/L)1NX1·探針(10μmol/L)1N×1N×13.5總體積6.3.4.3加樣：在樣本處理區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入制備好的RNA溶液94℃/20s,60℃/30s,40個循環(huán)。試驗檢測結(jié)束后，保存結(jié)果，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。6.4.2.2陽性對照的Ct值應(yīng)小于28.0,并出現(xiàn)典型的擴增曲線，兩個陽性對照擴增曲線基本重合。Ct值小于等于30.0,且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在水泡性口炎病毒。6;4.4結(jié)果處理如樣品經(jīng)熒光RT-PCR反應(yīng)判定為陽性；應(yīng)立即將原樣品按生物安全要求包裝送國家口蹄疫參考實驗室確認(rèn)。7VSV-NJ型和VSV-IND病毒，37℃吸附1h,棄去細(xì)胞瓶中接種的病毒液，加入維持液，置5%二氧化或超聲波處理，2000r/min離心20min,分裝成每小瓶1mL,置-70℃保存?zhèn)溆谩⒏餍筒《驹?6孔板上作10°~10-10稀釋，每孔病毒懸液為50μL,每個稀釋度作8孔，加入100μL細(xì)胞懸液(濃度3×10°細(xì)胞/mL),每孔再加入50μLE-MEM,每塊板設(shè)8孔細(xì)胞對照。置5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，從24h開始逐日觀察記錄CPE。按Karber方法計算出各型病毒的7.3.3.2.2陰性血清對照：設(shè)4孔陰性對照，每孔加陰性血清和100TCIDo/57.3.3.2.4陽性血清對照：將陽性血清分別作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128稀釋，每個稀釋(3×10?個細(xì)胞/mL)。8將每份被檢血清作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128稀釋，每個稀釋度作4個孔，每孔各加1h;加細(xì)胞懸液100μL(3×10?個細(xì)胞/mL),置37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后逐日觀察CPE清1:32出現(xiàn)50%以上保護(hù)、陰性孔細(xì)胞100%病變、正常細(xì)胞孔細(xì)胞形態(tài)正常、血清8.1.4·水泡性口炎病毒特異性單克隆抗體(VgV-McAb)。8.1.5羊抗鼠IgG-HRP;可從有關(guān)生物試劑公司購買，按說明書指定的工作濃度稀釋使用。8.1.6·包被液、洗滌液、封閉液、稀釋池、底物液、終止彼：配刷見附A。8.2.2.可拆96孔酶標(biāo)板。8.3.2用稀釋液按1:10稀釋陽性、陰性對照血清和所有被檢血清，被檢血清稀釋可在試驗前，1d進(jìn)b)每份被檢血清樣品加兩孔99223344PC55NCNC66NC7788注：BL—空白對照，PC—陽性血清對照，NC—陰性對照。1～42為樣品8.3.5McAb和羊抗鼠IgG-HRP的稀釋；McAH按說明書要求，用稀釋液稀釋，混勻；羊抗鼠IgG置37℃濕盒中感作30min。8.3.9洗滌酶標(biāo)板孔5次。8.3.10加底物液：在室溫下所有板孔加100/L底物液(此步要盡快完成),酶標(biāo)板置濕盒暗盒8.3.11加終止液：快速加入50μL孔終止液。終止后，應(yīng)在30min內(nèi)測定OD值，以免顏色發(fā)生8.3.13抑制百分比(PI)計算見式(1):在45%~50%之間的樣品判為可疑，應(yīng)重復(fù)試驗，如.PI仍在45%～50%之間，則判為陽性。(規(guī)范性附錄)A.1碳酸緩沖甘油無水碳酸氫鈉(NaHCO?)無水碳酸鈉(Na?CO?)蒸餾水A.1.2·碳酸緩沖甘油1份碳酸緩沖液加9份滅菌甘油混合即成。無水磷酸氫二鈉(Na?HPO?)無水磷酸二氫鈉(NaH?PO?)蒸餾水無水磷酸二氫鈉(NaH?PO?)三蒸水無水磷酸氫二鈉(Na?HPO?)三蒸水a(chǎn)液蛋白胨乳糖A.4變性液的配制檸檬酸鈉滅菌三蒸水水加至100mLTris-HCl250mmol/L,pH8.3氯化鉀(KCl)250mmol/L氯化鎂(MgCl?)50mmol/LDTT50.mmol/LTris-HCl500mmol/L,pH8.8氯化鉀(KCl)500mmol/LA.8上樣緩沖液每100mL水溶液中含：溴酚藍(lán)0.25g,蔗糖40g。去離子水中按0.1%加入DEPC(焦碳酸二乙酯),室溫或37℃靜置過夜，1.034×10?Pa高壓A.105×Tris-硼酸(TBE)電泳緩沖液0.5mol/LEDTA(pH8.0)三蒸水定容至溴化乙錠防止氣泡產(chǎn)生，使瓊脂糖厚度達(dá)3mm～5mm;待凝膠完全凝固后去掉梳子和兩端封口物，將凝膠托盤放入電泳槽，加入0.5×TBE電泳緩沖液使之高出凝膠磷酸氫二鈉(Na?HPO?)磷酸二氫鈉(NaH?PO.)氯化鈉(NaCl)水Q磷酸氫二鈉(Na?HPO?)磷酸二氫鉀(KH?PO.)水按說明書要求配制E-MEM培養(yǎng)基，加10%無水泡性口炎抗體的胎牛血清(經(jīng).56℃,30min滅A.16E-MEM細(xì)胞維持液按說明書要求配制E-MEM培養(yǎng)基，加2%無水泡性口炎抗體的胎牛血清經(jīng)56℃30.min滅活，含A.17細(xì)胞分散液胰酶乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)無鈣鎂PBS碳酸氫鈉(NaHCO?)碳酸鈉(Na?CO?)水氯化鈉(NaCl)磷酸二氫鉀(KH?PO?)磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)氯化鉀(KCl)水洗滌液或洗滌液