昆蟲抗菌肽的分離純化技術(shù)標準團體標準

1昆蟲抗菌肽的分離純化技術(shù)標準本標準規(guī)定了昆蟲抗菌肽的分離純化技術(shù)要求，本標準以家蠅作為材料提純血淋巴的抗菌肽。本標準適用于以家蠅為材料的抗菌肽分離純化，對于其他昆蟲等作為材料純化抗菌肽可參照執(zhí)行。本規(guī)程規(guī)定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS電泳、抗菌肽活性測定方法等技術(shù)要求。本規(guī)程適用于抗菌肽的快速分離。2規(guī)范性引用文件用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）適用于本文件。GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》GB/T6682-2016《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》GB4789.2-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定3術(shù)語下列術(shù)語和定義適用于本文件：3.1抗菌肽（antimicrobialpeptides）抗菌肽（antimicrobialpeptide，AMPs）是一種基因編碼的、在體內(nèi)誘導的、具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，強堿性、熱穩(wěn)定性、對細菌、真菌、病毒等微生物與寄生蟲有抑殺活性。某些抗菌肽還具有抑殺腫瘤、中和內(nèi)毒素、促進傷口愈合、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學功能。3.2家蠅（Muscadomestica）在25℃,相對濕度60%～70%的實驗室內(nèi)飼養(yǎng)家蠅，成蠅喂以白糖和奶粉，每日更換飲水。幼蟲以人工飼料（發(fā)酵麥麩）喂養(yǎng)。3.3多肽（polypeptides）介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，有2個或2個以上氨基酸通過肽鍵連接形成的一類化合物。23.4多肽活力（antimicrobialactivity）抑制微生物的能力，以抑菌圈直徑（mm）來表示。3.5熱處理（HeatTreatment）抗菌肽是一種弱堿性物質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性、耐低溫的特性。將家蠅血淋巴于沸水浴中攪拌加熱3min后，迅速在冰浴中冷卻，10,000r.p.m/min離心20min，除去變性蛋白，沉淀再用等體積蒸餾水洗2次，以同樣轉(zhuǎn)速離心20min，合并3次上清液。3.6超濾膜（ultrafiltrationmembrane）膜超濾方法經(jīng)常在分離純化的初期被用來進行蛋白質(zhì)樣品的富集和粗級的分離。該方法的關(guān)鍵是選擇不同類型和規(guī)格的膜。3.7高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC）高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。4試劑或材料除非另有說明，本方法所用的試劑均為分析純，實驗用水GB/T6682規(guī)定的水。4.1生理鹽水0.85%生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉，用一級水溶解并定容至1000mL.121℃高壓滅菌20min。4.2培養(yǎng)基LB（Lucia-Bertani）液體培養(yǎng)基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，ddH2O定容至200mL，混勻，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，2g瓊脂粉，ddH2O定容至200mL，混勻，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。PDA（PotatoDextroseAgar）培養(yǎng)基：200g去皮土豆，于ddH2O中煮沸30min，紗布（8層）過濾固體殘渣，后加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，繼續(xù)煮沸至完全溶解，用一級水溶解并定容至1000mL，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。4.3菌株革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（S.aureus）革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（E.coliK12D31）34.4Tricine-SDS-APGE49.5%T，3%C：48g丙烯酰胺，1.5g雙丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；49.5%T，6%C：46.5g丙烯酰胺，3g雙丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；電泳緩沖液：3.0MTris，0.3%SDS，pH8.25；陽極buffer：200mMTris，pH8.9；陰極buffer：100mMTricine，100mMTris，0.1%SDS，pH8.25；Loadingbuffer(2×)：3ml3MTris(pH8.25)，3mL80%甘油，0.8gSDS；1.5mg考馬斯亮藍R-250，0.5mg苯酚紅，加ddH2O定容至10ml；3MTris緩沖液(pH8.45)，36.3gTris堿，溶于80mLddH2O，用濃HCl調(diào)pH至8.45，定容至100mL。5儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱：溫度精度1℃電子天平：感溫為0.0001g和0.01g酶標儀（Bio-rad公司)：波長范圍190nm~900nm抑菌圈測量儀：精度0.02mm~0.1mm血球計數(shù)板：16格×25格或25格×16格玻璃器皿：直徑為90mm，底部平整Bio-rad垂直電泳儀器高效液相色譜儀(P680四元梯度泵、ASI-100自動進樣器、PDA-100檢測器及Chromleon6.4工作站)KromasilC18色譜柱（250×4.6mm，5um，300A）。6實驗步驟6.1家蠅飼養(yǎng)在25℃,相對濕度60%～70%的實驗室內(nèi)飼養(yǎng)家蠅，成蠅喂以白糖和奶粉,每日更換飲水。幼蟲以人工飼料（發(fā)酵麥麩）喂養(yǎng)。6.2家蠅抗菌肽的誘導家蠅3齡幼蟲經(jīng)0.85%生理鹽水洗滌，75%酒精消毒后，用微量注射器注射對數(shù)生長期的E.coliK12D31（濃度約為108個/mL）2μL/每頭，在高溫消毒的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)。46.3家蠅三齡幼蟲血淋巴的提取及檢測每次約20g三齡幼蟲，放入到預(yù)冷的研缽中，加入0.05M乙酸銨緩沖液5mL，并加入少許(0.1g)苯基硫脲，把蟲體剪碎、勻漿，用雙層紗布過濾，取濾液在10,000r.p.m/min離心20min，上清液通過紗布除去少量脂肪。再用5mL緩沖液沖洗殘渣，混勻，再用10,000r.p.m/min離心20min，取上清。然后合并2次上清，置于-80℃保存?zhèn)溆?參考附錄A)。6.4熱變性將上述方法所得血淋巴于沸水浴中攪拌加熱10min后，迅速在冰浴中冷卻，12,000r.p.m/min離心20min，除去變性蛋白，沉淀再用等體積蒸餾水洗2次，以同樣轉(zhuǎn)速離心20min，合并3次上清液。6.5超濾膜上清分別用截留10kDa的超濾離心柱10,000g超濾離心10min，收集濾過部分，然后用截留3kDa的超濾離心柱10,000g超濾離心10min，棄濾過部分，收集未濾過部分。Bradford法檢測10kDa超濾樣品的蛋白濃度，超濾前水解原液濃度為1.12mg/ml，超濾后截留液濃度為1.85mg/ml，濾過液濃度為0.48mg/ml，表明上層樣品得到了濃縮，小分子蛋白、無機鹽和水等在離心壓力下穿過小孔徑的濾膜，進入到超濾裝置的下層(參考附錄D)。6.6蛋白濃度的測定取10mg牛血清白蛋白，用ddH2O溶解并定容到100mL，其終濃度為100μg/mL。稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶解至50mL95%的乙醇中，加85%的磷酸100mL，用ddH2O定容至1000mL。按照附錄B配制標準曲線溶液(參考附錄B)。6.7HPLC經(jīng)超濾收集到的液體用0.1M的乙酸鈉透析過夜，直接上樣預(yù)先經(jīng)乙酸鈉（pH5.0，0.1M）平衡的CM-SepharoseCL-6B柱，然后以150mL平衡液對150mL，pH5.01M的乙酸鈉緩沖液作梯度展開，梯度結(jié)束后，再用300mL，1MNaAc（pH5.0）洗脫，流速為0.2mL/min，每1min收集一管，收集合并各活性峰，收集的蛋白冷凍干燥，-80℃保存(參考附錄C)。6.8Tricine電泳檢測(Tricine-SDS)制膠采用Bio-rad垂直電泳附件模具，制成0.75mm厚凝膠，分離膠分別制成20%T，6%C和15%T，3%C的梯度膠，堆積膠為8%T，3%C。恒電壓60v，1h后90v跑至膠盡頭。電泳完畢，膠置于0.25%考馬斯亮藍R250的甲醇∶水∶冰乙酸(5∶5∶1)染色液過夜。膠置含12.5%異丙醇10%醋酸中擴散脫色直至背景清晰。并利用CN-UV/WLImage-FormationSystem的Bioplot軟件對目的蛋白進行分析，測定該蛋白在總蛋白中的含量，即為其表達率(參考附錄D)。56.9平板打孔穴抑菌法6.9.1菌液活化分別挑取平板上的E.coliK12D31和S.aureus單菌落接種于2mLLB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)。取此培養(yǎng)液按1/100體積接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.3。6.9.2指示菌液制備按照GB4789.2進行指示菌的菌落計數(shù)。建立菌落計數(shù)與OD600的關(guān)系，調(diào)整至菌落數(shù)為5~1*106CFU/mL6.9.3制備平板取LB固體培養(yǎng)基約20ml，加熱融化后冷卻至45℃左右，加入60μl的工程細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，OD600=0.3)，搖勻，倒入9厘米玻璃培養(yǎng)皿。6.9.4測定用一打孔器(孔徑約3mm)沾取酒精經(jīng)火焰滅菌3次，在已含菌的平板上打孔，每孔加樣20μl純化的小肽，點樣后的平皿放入5℃冰箱培養(yǎng)12h讓抗菌肽充分擴散到瓊脂中以得到更大的抑菌效果，同時還可以抑制周圍污染菌的生長；然后將平皿放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果，在加有抗菌活性的抗菌肽周圍可形成一個清晰的圈，抑菌圈直徑為實際抑菌圈減孔直徑。抑菌試驗判定標準:抑菌圈直徑等于0mm為不敏，抑菌圈直徑≤5mm為低敏，抑菌圈直徑等于5~7mm為低度敏感，抑菌圈直徑等于7~11mm為中度敏感，抑菌圈直徑≥11mm為高度敏感(參考附錄E)。6（資料性附錄）家蠅血淋巴的的Tricine-SDS（資料性附錄）配制標準曲線溶液體系取0.1mL待測樣品用ddH2O稀釋10倍后，加入5mL配好的考馬斯亮藍染色液，測其A595。溶液（mL）編號012345牛血清白蛋白00.8ddH2O0.20考馬斯亮藍5.05.05.05.05.05.08（資料性附錄）家蠅三齡幼蟲血淋巴的HPLC分析9（資料性附錄）kDa97.466.24331MS1U1M