貝類、果蔬和水樣中脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測方法 普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法

貝類、果蔬和水樣中脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測方法普通RT-PCR方法和本標準規(guī)定了貝類、果蔬和水樣中脊髓灰質(zhì)炎病毒普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法。本標準適用于貝類、果藍和水樣中脊髓灰質(zhì)炎病毒的定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求下列術(shù)語和定義適用于本標準。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。一種包含病毒特異性cDNA片段的重組質(zhì)粒分子，可作為病毒PCR檢測中的陽性對照。4方法提要用合適的裂解液(如Trifeagen)提取貝類樣品中病毒RNA.并根據(jù)脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA3’末端含有Poly(A)的結(jié)構(gòu)，用連接Oligo(dT)2的磁珠特異性吸附骨酯灰質(zhì)炎病毒RNA進行純化。對水樣中的病毒進行富集后，采用合適的方法提取和純化病毒RNA。用合適的緩沖液洗脫果蔬樣品表面病毒后，對病毒進行富集，并采用合適的方法提取純化病毒RNA。利用普通RT-PCR或?qū)崟r熒光RT-PCR方法進行檢測。本研究通過構(gòu)建質(zhì)粒標準分子(每個質(zhì)粒分子包含1拷貝擴增片段》,確定適于工型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測的善通RT-PCR體系檢測下限均為50拷貝，實時熒光RT-PCR體系檢測下限均為2拷貝。所有實驗用試劑均為分析純；除特別說明外，實驗用水為蒸餾水或去離子水。5.1陽性標本：脊髓灰質(zhì)炎病毒，-80℃冰箱保存；或含脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測目的片段的質(zhì)粒標準分子，-20℃冰箱保存，5.2甘氨酸緩沖液；見A.1.1。表1三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒普通RT-PC5'CAGTGAACGTCATGTGGAATAGAG-3”日標5'-CTGAGTGGCCAARTGGTAGTTG-3”5'FAM-TGTACACTGCAGGTTAⅡ型病毒5'-CGACTTATGGATTTG5'-FAMTGTACACNGCTGGCTAC-5'-ATGGTTTTGGGCATCAGAATA5'-FAM-ACACTGCTGGTTACAAG-MGB-a”注1:R:A/G。注2:探針也可選用具有與FAM和MGB熒光基團相同檢測效果的其他合適的熒光報告基團和熒4向上清液中加入0.5倍體積(約2.5mL)異丙醇，顛倒混勻后，室溫放置5min,4℃,5000g棄盡上清液，用5mL,,4℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀。0重復(fù)步驟兩次，最后一次棄盡上清液。1沉淀重懸于300μL超純水(無RNase和DNase污染)中，將懸液轉(zhuǎn)移至一1.5mL離心2加人400μL.1×RNA吸附緩沖液，振蕩30s,60℃放置3min。3加入100μlOligo(dT)g磁珠，輕柔混合，磁性抽提架上故置1min。4棄盡上清液，加入500pL2×RNA吸附緩沖液，室溫下晃動5min洗滌。5離心管在磁性抽提架上放置1min,棄盡上清液。加入500pl.漂洗緩沖液，顏倒混勻5次，離心管在磁性抽提架上放置1min,棄去上清液。6重復(fù)步驟5三次。7沉淀用100pL.超純水(無RNase和DNase污染)懸浮，90℃放置2min釋放RNA。離心管在磁性抽提架上放置1min。將上清液移至另一1.5ml.離心管中，可即吸取5μL進行RT-PCR檢測。7.2.2水樣中脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA提取(使用Qingen公司QLAampViralRNAMiniKit)用50mL針管分次取100mL～200ml,水樣過一直徑為47mm,孔徑為0.45μm的乙酸/硝酸混合纖維素濾膜，小心取出濾膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中。向薄膜袋中加入1130pl.BufferAVLcarrierRNA混合液，使濾膜充分浸于緩沖液中。刷烈振滿15s~30s,室溫浸泡濾膜20min～30min后，小心將液體完全轉(zhuǎn)移到15mL.離心管中。(可選步驟)若回收液體中存在明顯可見的固體物質(zhì)，4000g離心3min.轉(zhuǎn)移上清液至一新15mL.離心管中。加入1120pL無水乙醇，刷烈振蕩15s,5000g離心15s收集液體。將上述液體630μL轉(zhuǎn)移至帶有2mL收集管的離心柱中，6000g離心1min,棄收集管中液重復(fù)步驟,直至所有混合液均通過離心柱，最后一次離心后將離心柱放入一新2mL收集管中。加入500gLBufferAW1,6000g離心1min.將離心柱放入一新2mL收集管中。加入500μLBufferAW2,20000g離心3min。將離心柱放人一新2ml.收集管中，20000g離心1min以徹底除去殘余在離心柱膜上液體。0將離心柱放入一新1.5ml.離心管中，小心的在離心柱膜中央加人60pl.BufferAVE,室溫放置1min~2min,6000g離心1min。1.5mL離心管中的液體即為提取的病毒RNA樣品，可即吸取7.2.3蔬菜和水果樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA提取!《使用Qiagen公司QLAampViralRNAMini取15g左右水果或蔬菜樣品裝入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液(pH9.5),250r/min37℃或室溫振蕩30min。將裝有水果或蔬菜樣品的混合液于4℃,12000g離心30min。轉(zhuǎn)移上清液至一新50ml.離心管，加入等體積PEG8000溶液，顛倒混勻足次。4℃放置過夜：4℃.12000g離心30min.棄盡上請液，保留沉淀。23表4(續(xù))1一2超純水(無RNase和DNase污染)一——病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)參數(shù)：37℃,20min85℃,5st——普通PCR反應(yīng)參數(shù)194℃,2min;94℃,30s,58℃,30s,72℃,30s,40個循環(huán)。72℃,5min。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制溴化乙錠含量為0,5xg/ml.的1.5%瓊脂糖凝膠。取PCR產(chǎn)物15pL,加1,5pl.上樣緩沖液點樣進行電泳，并在其中一孔道加入DNA分子量標記以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電壓大小根據(jù)電泳槽長度來確定，一般控制在3V/cm～5V/cm,當溴酚藍移動到凝膠邊緣時關(guān)閉電源，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄。普通RT-PCR檢測下限I型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒普通RT-PCR體系檢測下限均為50拷貝質(zhì)粒標準分子DNA。7.3.2實時熒光RT-PCR實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)體系見表3,PCR反應(yīng)體系見表5,表6。每個反應(yīng)體系設(shè)置兩個平行反應(yīng)。其中POL-FPI/RP1/Probel用于I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的實時熒光RT-PCR檢測；POL-FP2/RP2/Prohe2用于Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的實時熒光RT-PCR檢測：POLFP3/RP3/Probe3用于Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的實時熒光RT-PCR檢測。三對引物和探針可分別用于工、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測，檢測體系見表5。對三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒也可實施同時檢測(同一反應(yīng)管檢測),即將三對引物和三條探針同時加入反應(yīng)管，反應(yīng)體系見表6。以脊髓灰質(zhì)類病毒cDNA或含脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測目的片段的質(zhì)粒標準分子DNA作為陽性對照模板，以不含有脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA或脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測目的片段的質(zhì)粒標準分子DNA的樣品作為陰性對照模板，以水代替模板作為空白對照。 ”當對Ⅱ型管髓灰質(zhì)類病毒進行檢測時，引物和探針分別為POL-FP2/POL-RP2,POI.Prohe2;當對Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒進行檢測時，引物和探針分別為POL-FPa/POL-RPb該試刻只在具有ROX熒充通道校正的實時熒光PCR儀表6對三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒同時進行實時熒光RT-PCR檢測的反應(yīng)體系5實時熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)!——病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)參數(shù)：37℃,20min;85℃,5s;——對三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒分別進行實時熒光PCR檢測的反應(yīng)參數(shù)：95℃,10s:95℃,5s.60℃,31s.45個循環(huán)；對三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒同時進行實時熒光PCR檢測的反應(yīng)參數(shù)；95℃,10s195℃,5s.60℃,31s,45個循環(huán)。實時熒光RT-PCR檢測下限對工型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒分別檢測的實時熒光RT-PCR體系檢測下限均為2拷貝質(zhì)粒標準分子DNA;對三種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒同時檢測的實時蒙光RT-PCR體系檢測下限為2拷貝質(zhì)粒標準分子DNA。8結(jié)果判斷及表述8.1結(jié)果判定 a)陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)265bp的且的擴增條帶則表明反應(yīng)體系運行(規(guī)范性附錄)溶液的配制A.1普通溶液的配制A.1.1甘氨酸緩沖液：含0.1mal/1.甘氨酸，0.3mol/L.氯化鈉(NaCl),pll9.5甘氨酸甘氨酸7.5g氯化鈉17.5g雙燕水800ml5mol/L.氨氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5加雙蒸水至1000mL,121℃,15min滅菌備用。A.1.2PEGB000溶液；含16%(質(zhì)量濃度)PEG8000,0.525mol/L.氯化鈉氯化鈉3.07g加雙蒸水至100mL,121℃,15min滅菌備用。A.1,3PBS緩沖液(20×),pH7.5氯化鈉15.75g氯化鉀4g磷酸氫二鈉28.8R磷酸二氫鉀4.83g雙蒸水800ml.加雙蒸水至1000mL,121℃.15min滅菌備用。使用時用滅菌雙燕水稀釋至1×使用。A.1.450×TAE緩沖液A.mol/LEDTA-Ne·2H?O(二水乙二銨四乙酸鈉)溶液，pHB.0滅菌雙蒸水5mol/1.氨氧化鈉溶液滅菌雙蒸水加至1000ml,121℃,15min滅菌備用。A.1.4.2TAE電泳緩沖液(50×)羥基甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57.1mL.滅菌雙蒸水加至1000mL,121℃,15min滅菌備用。使用時用滅菌雙蒸水稀釋至1×使用。A.1.5溴化乙錠(EB)溶液(10mg/mL)EB滅菌雙蒸水20mlA.1.6含0.5μg/mL溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1.5g(資料性附錄)有代表性的脊髓灰質(zhì)炎病毒株eDNA序列GenBank編號和擴增序列B.1有代表性的I型脊情灰質(zhì)炎病毒株cDNA序列的GenBank編號；AY184219.1擴增序列(3474hp~3738bp)cagtgaacgtcatgtggaatagagacctettagtcacngaatcaagageccngggeacegattcaategcanggtgeaattgentgtactactgegngtetaganggaantactaccengtateettegttggcecancgttcengtacatggaggetaatanetattacccagetgteccatatgetcattggtcatggattegeatetecaggggattgtggtggcatactcagatgtB.2有代表性的Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒株cDNA序列的GenBank編號：A