芒果枝枯病擬莖點霉菌生物學特性研究

芒果枝枯病擬莖點霉菌生物學特性研究符致蕾1，楊石有1,2*，張蕊1，張賀3（1.海南大學，海南儋州571737；2.河北農業(yè)大學植物保護學院，河北保定071001；3.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南海口571101） 摘要：以芒果枝枯病擬莖點霉菌（PhomopsismangiferaeAhmad）為供試菌，采用菌絲生長速率法，考查了不同溫度、pH、碳源、氮源、致死溫度及時間、光照時間及不同芒果組織對病原菌菌絲生長的影響。結果表明：菌絲生長最適溫度范圍為25～30℃，以28℃生長最好；最適pH值為7；最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為蛋白胨、牛肉膏；致死溫度為50℃處理30min或55℃處理20min；光照時間和不同芒果組織對菌絲生長影響不明顯。關鍵詞：芒果；擬莖點霉菌；生物學特性芒果(MangiferaindicaL.)，素有“熱帶果王”的美譽。我國芒果主要分布在海南、廣東、廣西、云南、四川、福建和臺灣，經(jīng)過多年發(fā)展，芒果產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為主產(chǎn)區(qū)重要的農業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。隨著種植規(guī)模的擴大和種植年限的延長，芒果病害種類也逐漸增多[2]。芒果枝枯?。═ipDiebackofMango）又稱芒果回枯病、頂枯病、流膠病等，在世界芒果產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生。該菌主要為害枝條和莖干，以新抽嫩梢為主，發(fā)病初期，病部出現(xiàn)水漬狀褐色病斑，后變黑色；病部開裂并流出乳白色樹脂，后期樹脂變?yōu)辄S褐色、棕褐色至黑褐色；病斑擴大環(huán)繞枝條，且向上、向下擴展，最后病部以上的枝條枯死，黑褐色，病部長出許多黑色顆粒。剖開病枝（莖），木質部變淺褐色。受害枝條的葉片從葉柄沿葉脈擴展，褪綠變成黃褐色，嚴重時整個葉片干枯。幼樹感病，可致整株枯死。嚴重時受害枝條從顯癥至枯死僅3～5d[3]。芒果枝枯病為真菌性病害，Khanzada等[4]人認為不同的環(huán)境條件病原菌有所不同。Ramos[5]等報道了美國佛羅里達州的芒果枝枯病病原菌為Botryosphaeriaribis，Khanzada等[4]報道了巴基斯坦芒果枝枯病病原菌為Lasiodiplodiatheobromae，而Savant等[6]認為Colletotrichumgloeoaporioides可侵染芒果引發(fā)為芒果枝枯病。而國內關于芒果枝枯病病原的報道較少，胡美姣[3]等人報道了海南的芒果枝枯病病原菌為LasiodiplodiatheobromaePat。芒果擬莖點霉菌（PhomopsismangiferaeAhmad）[2]是近年來由張賀等人發(fā)現(xiàn)并鑒定的芒果枝枯病病原菌，國內對該病菌生物學特性研究較少且不系統(tǒng)，為了解該病原菌的生物學特性，以期為該菌的藥劑防治提供參考，筆者開展了此試驗，現(xiàn)將研究結果報道如下。1材料與方法材料芒果擬莖點霉菌（PhomopsismangiferaeAhmad）由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供，經(jīng)病原鑒定后保存使用。方法1.2.1溫度對菌絲生長的影響將在PDA平板（新鮮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂22g、1000ml蒸餾水）上培養(yǎng)三天的病菌菌落打成6mm的菌餅，接種于PDA平板中央，分別置于10、15、20、25、28、30、35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。1.2.2pH值對菌絲生長的影響用0.1mol/L鹽酸溶液和0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)滅菌的PDA培養(yǎng)基，制成pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板，接種直徑為6mm的菌餅，28℃下培養(yǎng)48h，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理設3個重復。1.2.3光照時間對菌絲生長的影響在PDA平板上接種培養(yǎng)三天的6mm病菌菌餅，分別置于L:D為24:0、18:6、12:12、6:18和0:24的培養(yǎng)箱中，28℃下培養(yǎng)24h，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理設3個重復。1.2.4碳源對菌絲生長的影響以Czapek固體培養(yǎng)基(NaNO32g,K2HPO41g,KCl0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g，瓊脂20g,水1000mL)為基礎培養(yǎng)基，分別與等摩爾C量的果糖等8種碳源替換Czapek固體培養(yǎng)基中的蔗糖，供試碳源分別為麥芽糖、甘露醇、D-木糖、D-果糖、乳糖、蔗糖、D-半乳糖、葡萄糖及不加糖(CK)，制成不同碳源的培養(yǎng)基，接種6mm的病菌菌餅，28℃下培養(yǎng)48h，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理設3個重復。1.2.5氮源對菌絲生長和的影響以Czapek固體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別與等摩爾N量的尿素等8種氮源替換Czapek固體培養(yǎng)基中的硝酸鈉，供試氮源分別為蛋白胨、牛肉浸膏、L一精氨酸、甘氨酸、尿素、硝酸鈉、硝酸銨及不加氮(CK)，制成不同氮源的培養(yǎng)基，接種6mm的病菌菌餅，28℃下培養(yǎng)48h，以十字交叉法測量菌落直徑，每個處理設3個重復。1.2.6致死溫度和時間的測定分別在40、45、50、55、60、65℃的恒溫水浴鍋中放入長有菌落的PDA平板（在28℃下培養(yǎng)72h，生長良好且無污染），同一溫度下處理的平板分別處理10、20、30min后迅速冷卻，在處理后的PDA平板上的菌落沿邊緣用6mm打孔器打出供試菌菌餅，將菌餅接在PDA平板上培養(yǎng)48h，觀察菌絲生長情況。每個處理3個重復。1.2.7芒果不同組織對菌絲生長的影響從海南省東方市芒果園分別采集臺農與貴妃兩種品種芒果的枝，葉和花。稱取等重的枝、葉、花，切碎后分別放入沸水中煮20分鐘后過濾除去殘渣得到濾液。用不同的濾液替代Czapek基礎培養(yǎng)基中的蒸餾水，定容到1000ml，得到不同品種且不同生長部位的培養(yǎng)基。分別接種6mm的菌餅，置于28℃下培養(yǎng)24h，以十字交叉法測量菌落直徑，每個處理設3個重復。結果與分析2.1溫度對菌絲生長的影響不同溫度對供試菌株的生長影響見圖1。從圖1可知，溫度對芒果枝枯病擬莖點霉菌影響較大，各溫度之間差異顯著。菌株在10℃、15℃時不生長，15℃時開始生長，當溫度超過20℃時，菌株生長速率大大提升，28℃時達到最大值，24h菌落直徑達到30.2mm，當超過28℃時，菌株的生長速率逐漸減慢。圖1溫度對芒果擬莖點霉菌菌絲生長的影響注：圖中不同英文小寫字母表示經(jīng)鄧肯多重復比較，相互間達差異顯著（p=0.05），下同。2.2pH值對菌絲生長的影響不同pH值對菌株的生長見圖2。菌株在pH值3.0～11.0間，菌絲均能生長，pH值為7時生長速率最快。，48h菌落直徑達到28.7mm；在pH值為4～7間，菌絲生長較快，尤其是pH值為4和7時，菌絲生長最快，說明芒果擬莖點霉菌適宜在偏弱酸和中性環(huán)境生長。圖2pH值對菌絲生長的影響2.3光照時間對菌株菌絲生長的影響不同光照時間對菌株菌絲生長的影響見圖3。芒果擬莖點霉菌的生長受光照時間的影響并不明顯，全光照、全黑暗、光暗交替處理，菌絲直徑均大于30mm。圖3光照時間對菌絲生長的影響2.4碳源對菌絲生長的影響不同碳源對菌株菌絲生長的影響見圖4。芒果擬莖點霉菌在8種碳源培養(yǎng)基上均能生長，但偏好不同。菌株在麥芽糖培養(yǎng)基上的生長好于其它培養(yǎng)基，菌絲直徑達33.8mm；其次是乳糖、木糖，在葡萄糖和半乳糖培養(yǎng)基上生長最差。圖4不同碳源對芒果擬莖點霉菌菌絲生長的影響2.5氮源對菌絲生長和的影響不同碳源對菌株菌絲生長的影響見圖5。芒果擬莖點霉菌在8種氮源培養(yǎng)基上均能生長，且表現(xiàn)出了對不同氮源的偏好。菌株在蛋白胨和牛肉膏培養(yǎng)基上生長好于其他培養(yǎng)基，48h后菌落直徑分別達到了26.8mm和32.2mm，其次是尿素、甘氨酸培養(yǎng)基，在硫酸銨培養(yǎng)基上生長最差，其在不加氮源的培養(yǎng)基上的生長與在尿素、甘氨酸上相當。圖5不同氮源對芒果擬莖點霉菌菌絲生長的影響2.6致死溫度和時間的測定不同致死溫度及時間對菌株菌絲生長的影響見圖6。菌株在水溫40～45℃處理10～30min、50℃處理10～20min和55℃處理10min的菌絲，均能在PDA培養(yǎng)基上再生長，但50℃處理30min和55℃處理20min(及20min以上)后菌絲均不能生長，表明菌絲致死溫度為50℃處理30min或者55℃處理20min。溫度/℃時間/min(菌落直徑±標準差/mm)401019.8±1.0ab2021.8±0.8a309.80±2.4d451019.7±2.8ab2021.3±0.3a306.30±1.6e501015.3±2.9c2011.0±0.5d300.00±0.0f551018.5±0.5b200.00±0.0f300.00±0.0f60100.00±0.0f200.00±0.0f300.00±0.0f表1不同致死溫度及時間對菌株菌絲生長的影響注：表中不同英文小寫字母表示經(jīng)鄧肯多重復比較，相互間達差異顯著（p=0.05）。2.7芒果不同組織對菌株菌絲生長的影響不同芒果組織培養(yǎng)條件下菌株菌絲生長情況見圖6。菌株在不同芒果部位制得的培養(yǎng)基上生長情況不同，表現(xiàn)出對不同部位的偏好。其在由臺農的花制備的培養(yǎng)基上長勢最好，而在貴妃的枝、花、葉與臺農的枝、葉培養(yǎng)基上，生長速率并無顯著差別，在貴妃的枝、花、葉上的整體生長狀況要好于臺農的枝、葉。圖6芒果不同組織對芒果擬莖點霉菌菌絲生長的影響結論與討論目前關于芒果擬莖點霉菌的研究還較少，張賀[2]將其列為芒果枝枯病的病原菌。研究表明，不同溫度、pH、碳源、氮源、致死溫度及時間、光照時間等對病原菌菌絲生長均能產(chǎn)生一定的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，菌株對溫度、pH值的適應范圍廣，最適溫度范圍為25～30℃，菌絲生長的最適溫度是28℃，在溫度低于15℃時病原菌停止生長；菌株最適pH值為7，這與謝玲[7]等的研究結果（最適溫度25～31℃，最適pH值6.0～6.5）基本一致。菌株對光照、氮源和碳源的營養(yǎng)條件要求不嚴格，表現(xiàn)出較強的適應性。菌株菌絲生長最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為蛋白胨、牛肉膏。菌株表現(xiàn)出較高的耐熱性，菌絲致死溫度為50℃處理30min或55℃處理20min；菌株在不同品種芒果組織制得的培養(yǎng)基上生長速率差別不大，均有較好的生長，說明該病原菌侵染能力較強。本實驗對芒果擬莖點霉菌的生物學特性進行了初步的探究，至于病原菌的防控技術，還需更進一步對病原菌的防治藥劑篩選、抗藥性、侵染過程和致病性機理等方面作進一步研究，以期為芒果枝枯病的防治提供更加有效的理論基礎。參考文獻[1]賀軍虎,陳業(yè)淵,魏守興.中國杧果產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀、存在問題與發(fā)展對策[J].熱帶農業(yè)科學,2006,26(6):59-62[2]張賀,韋運謝,劉曉妹,等.芒果病害名錄[J].中國熱帶農業(yè),2015,02:58-64.[3]胡美姣,張賀,高兆銀,等.臺風雨后應嚴防芒果枝枯病[J].中國熱帶農業(yè),2012,01:60-61.[4]KhanzadaMA,LodhiAMandShahzadS.PathogenicityofLasiodiplodiatheobromaeandFusariumsolanionmango[J].PakistanJournalofBotany,2004,36(1):181-189[5]RamosLJ,LaraSP,McMillanRTJr,etal.Tipdiebackofmango(Mangiferaind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