低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)-第二講

低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)

第二講低溫生物醫(yī)學(xué)基本原理之一

-----溶液的凍結(jié)特性與細(xì)胞損傷迄今為止，人們采用的低溫保存方法，都是將細(xì)胞、組織置于含有抗凍劑的水溶液中進(jìn)行降溫、復(fù)溫的，而在細(xì)胞內(nèi)部也是富含多組分的水溶液。

因此，研究多元溶液的凍結(jié)、融化特性，以及他們可能對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷是低溫生物醫(yī)學(xué)的重要任務(wù)之一。2.1水-冰相圖三相點(diǎn),溫度為273.16K,壓力為610.62Pa(冰點(diǎn)?)1atm,凍結(jié)點(diǎn)是273.15K(冰點(diǎn)?)，這一段是冰水平衡線(給我們什么啟示?降低冰點(diǎn)？)是冰和水蒸氣平衡線(給我們什么啟示?)2.2純水的凍結(jié)特性tT０℃abcde樣品溫度降溫槽溫度降溫曲線a-b段：水以釋放顯熱的方式降溫；b-c段：當(dāng)過冷到b點(diǎn)時，冰晶形成，釋放的潛熱使樣品的溫度迅速回升到0℃；c-d段：水在平衡條件下，繼續(xù)析出冰晶，不斷釋放大量固化潛熱。d-e段：全部水被凍結(jié)后，固化的樣品以較快速率降溫。特別指出：d-e段的降溫速率可能遠(yuǎn)大于槽溫的下降速度，因此在生物細(xì)胞的低溫保存中，如何控制溶液固化后的冷卻速率是熱控制的一個重要問題和難點(diǎn)。討論：怎么來控制？2.3過冷(supercooling)vs成核(nucleation)冰晶的成核過程主要由熱力學(xué)條件決定，而冰晶生長過程主要由動力學(xué)條件決定。等溫等壓條件下固液兩相體系的平衡條件是：液相吉布斯函數(shù)固相吉布斯函數(shù)冰點(diǎn)欲產(chǎn)生結(jié)晶的自發(fā)過程（即b到c），必須使液體過冷到某一低于Tf的溫度Tc。則有:過冷度形成冰晶的相變驅(qū)動力過冷度越大，驅(qū)動力也越大！怎么實(shí)現(xiàn)較大過冷度？成核理論當(dāng)水處于過冷態(tài)(亞穩(wěn)態(tài))時,可能以兩種形式成核,即均勻成核(homogenousnucleation)和非均勻成核(heterogenousnucleation).均勻成核,是指在一個體系內(nèi)各處的成核幾率相等,由于熱起伏(或熱漲落)可能使原子或分子一時聚集成為新相的集團(tuán)(又稱胚芽,embryos),若胚芽大于臨界尺寸r*,則成為晶核。若液相分子熱起伏聚集的冰相集團(tuán)尺寸大于r*，則結(jié)冰過程為自發(fā)過程。胚芽區(qū)晶核區(qū)r*O固相的形成能固相尺寸r過冷度（℃）-30-20-10004080120晶核的臨界尺寸r*（A）當(dāng)水的過冷度增加時，偏離平衡態(tài)的程度增加，冰晶核的臨界尺寸和形成能就劇烈降低，這樣就極大地提高了形成冰晶核的幾率。怎樣才能形成較大過冷度？非均勻成核，又稱異相成核，是指水在塵埃、容器表面及其它異相表面等處形成晶核。一般所要求的過冷度比均勻成核要小得多。在實(shí)際樣品凍結(jié)過程中，過冷點(diǎn)（通常與凍結(jié)點(diǎn)混淆）具有一定的隨機(jī)性！那我們要怎么解決這個問題？2.4冰晶形成生長過程及其對細(xì)胞的影響（一）降溫速率的影響慢速降溫

形成晶核少，冰晶生長速率快，最終形成數(shù)目較少但體積較大的冰晶。快速降溫

形成晶核多，冰晶生長受限制，最終形成數(shù)目多而體積小的冰晶。（二）“置核（seeding）”的必要性在實(shí)際降溫過程中，水或溶液中可能出現(xiàn)較大過冷度；潛熱釋放完全后，可能出現(xiàn)很高的降溫速率。這兩種情況對細(xì)胞來講都是不利的。因此，將事先浸入液氮中的細(xì)絲取出，并輕輕接觸溶液表面，在極小的局部區(qū)域形成較大的過冷度，形成晶核。這有點(diǎn)像人工降雨中使用的降雨彈功能?。。ㄈo論何種結(jié)晶，冰晶的存在都會對細(xì)胞產(chǎn)生致命的損傷??！coolingheating-135℃T(-90℃,-100℃,-110℃,-120℃,-130℃,-135℃)-82℃25℃10min-5℃/min60℃/minTheeffectsoffinaltemperatureoffirstcoolingoninducingformationofnuclei（YiXuetal.Unpublished,2013）Below-110C,therearesmalldifferencebetweenVs55andVs55+Fe;Buttheyareverydifferentatbetween-110Cto-82C,whichmeansVs55ismoreeasytoformnucleiabove-110Cbeforedevitrification.Why?n=3-135℃T(-90℃)-82℃25℃10min-5℃/min10℃/minCrystalsmaynotbewatchedintimewhenusing60C/min.Tomakesureenoughtimetofindthenucleusandclearlywatchthesubsequentcrystalsgrowingwhenpassingthroughthedevitrificationregion,10C/minwasusedhere.-80C-70C-65CVS55VS55+Fe復(fù)溫過程冰晶的再生長的確存在2.5二元溶液的凍融特性溶液的概念兩種或多種物質(zhì)均勻混合且彼此呈分子狀態(tài)分布。包括氣、液、固三態(tài)。二元溶液凍結(jié)曲線FABE273DTATBTE0CωAωBωE溶液溶液+溶質(zhì)凍結(jié)溶液冰+溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω溫度T(K)如果初始濃度較大，且降溫速率很高，溶液來不及析出冰，就會使全部溶液非晶態(tài)固化。若濃度過高呢？（一）稀溶液的依數(shù)性質(zhì)拉烏爾定律（Raoult’slaw）

溶液中水的蒸汽壓降低值等于純水的蒸汽壓乘以溶質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)，即在相同外壓下，稀溶液的沸點(diǎn)要高于純水的沸點(diǎn)，其升高值正比于溶液的質(zhì)量摩爾濃度***實(shí)際水溶液冰點(diǎn)降低的依數(shù)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)證明，對于理想的稀溶液，其冰點(diǎn)的降低正比于溶液的質(zhì)量摩爾濃度?！鱐f=Tf0-TfTf0——純水的冰點(diǎn)Tf——溶液的凍結(jié)點(diǎn)這個結(jié)論可以解釋什么？（二）被凍結(jié)組織融化過程的特點(diǎn)融化過程的作用是將已凍結(jié)的細(xì)胞、組織復(fù)溫，力求使之恢復(fù)到原先未凍結(jié)前的狀態(tài)。雖然它是凍結(jié)過程的反過程，但融化過程的熱控制要比凍結(jié)過程更為困難？？冰的比熱是水的一半，導(dǎo)熱系數(shù)卻是水的4倍，熱擴(kuò)散系數(shù)為8.6倍。比熱[J/(kg.K)]導(dǎo)熱系數(shù)[W/(m.K)]熱擴(kuò)散系數(shù)（m2/s）冰21202.2411.5×10-7水4217.30.5611.3×10-7凍結(jié)過程：樣品外層首先被凍結(jié)，繼續(xù)通過這個凍結(jié)層進(jìn)行吸熱。融化過程：樣品外層首先被融化，供熱過程必須通過這個液體層。（可以將降溫槽設(shè)定得很低，以提高降溫速率，融化過程可以采用類似的處理方法嗎？如何解決？）細(xì)胞體積隨滲透壓的變化（凍結(jié)過程）（三）凍融過程中的滲透現(xiàn)象怎么評估細(xì)胞體積隨滲透壓的變化01進(jìn)行無量綱化處理

1-骨髓細(xì)胞；2-酵母細(xì)胞；3-倉鼠細(xì)胞；4-紅細(xì)胞（Mazur,1970）2.6細(xì)胞低溫?fù)p傷的機(jī)理分析此圖的重要意義在于告訴人們，對于某一種細(xì)胞和某一確定的保存方案，確實(shí)存在著某種最佳冷卻速率，對應(yīng)最大的存活率，而過快或過慢的冷卻速率都會導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，降低存活率。細(xì)胞低溫?fù)p傷的兩因素假說存活率冷卻速率(Mazur,1972)胞內(nèi)冰損傷溶液損傷總效果胞外出現(xiàn)冰（胞外冰）；胞外溶液濃度增加；胞內(nèi)水分及時向外滲透;細(xì)胞激烈收縮；胞內(nèi)不出現(xiàn)冰（無胞內(nèi)冰）。凍結(jié)以前:慢速冷卻過程:（細(xì)胞小、膜滲透率高、降溫慢）水（多）胞外溶液胞內(nèi)溶液等滲不等滲胞外出現(xiàn)冰（胞外冰）；胞外溶液濃度增加；胞內(nèi)水分來不及向外滲透;胞內(nèi)溶液過冷;胞內(nèi)出現(xiàn)冰（胞內(nèi)冰）。凍結(jié)以前:快速冷卻過程:（細(xì)胞大、膜滲透率低、降溫快）水(少)胞外溶液胞內(nèi)溶液等滲不等滲2.7關(guān)于兩因素假說的深入研究Leibo用低溫顯微系統(tǒng)研究了鼠胚胎，用復(fù)雜細(xì)胞證實(shí)了Mazur的兩因素理論。慢速降溫時，細(xì)胞逐步脫水收縮；快速降溫時，細(xì)胞體積沒有明顯變化，單細(xì)胞內(nèi)部變黑，這是因?yàn)榘麅?nèi)冰對光線的散射所致！利用低溫顯微系統(tǒng)，定量研究了胞內(nèi)冰形成和滲透過程中細(xì)胞體積的變化情況"AMicroscopeDiffusionChamberForDeterminationOfTheEquilibriumAndNon-EquilibriumOsmoticResponseOfIndividualCells,"J.J.McGrathJ.Microscopy,139,249-263,1985.利用低溫顯微系統(tǒng)測量了細(xì)胞的水滲透率和遷移的活化能華澤釗（1987）利用自行研制的低溫顯微系統(tǒng)，研究人體白細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、魚胚胎時，觀察到：過慢冷卻時，細(xì)胞劇烈收縮，過快冷卻時，出現(xiàn)了胞內(nèi)冰。

2.8凍結(jié)過程中的未凍水份額當(dāng)水溶液或生物樣品被冷卻至其初始凍結(jié)溫度后，就不斷有冰晶形成和生長。由于冰晶中成分幾乎全是純水，從而提高了未凍基質(zhì)（unfrozenmatrix,UFM）濃度，這種濃度的升高會嚴(yán)重影響生物樣品中細(xì)胞進(jìn)行低溫凍存時的存活率。獲得未凍水的方法對于生物樣品中未凍水份額一般采用估算方法（利用稀溶液冰點(diǎn)降低性質(zhì)）；也有采用一般掃描DSC方法測定（存在熱事件滯后）；華澤釗采用低溫顯微圖象分析法（與圖像識別精度有關(guān)）；我們采用分布掃描DSC方法測定（YiXuetal,Cryo,2007）。

ΔH—由DSC獲得的焓差；x1—血管干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；x2—血管中DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Cp,art—血管干物質(zhì)的比熱，取為1.23J/g.℃[8]；Cp,DMSO—DMSO的比熱，取為1.97J/g.℃[8]；y—某一溫度T（≤初始凍結(jié)溫度Tf）下冰晶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；ΔHlat—某一溫度下純水冰相變潛熱，J/g；Tf—初始凍結(jié)溫度，℃；T—樣品溫度，℃。2.9復(fù)溫過程中的細(xì)胞損傷在許多情況下，細(xì)胞能在最佳冷卻速率下降至低溫，并長期保存在-196℃。但極有可能在復(fù)溫過程中遭受損傷而死亡。？原因經(jīng)冷凍后膜的滲透率發(fā)生變化，可能造成滲透率過大或過小，甚至完全沒有滲透功能。滲透率未變，但復(fù)溫過程發(fā)生細(xì)胞溶解。復(fù)溫過程發(fā)生再結(jié)晶。胞內(nèi)冰的形成一定會對細(xì)胞產(chǎn)生致命的損傷嗎？Mackenzie（1970）將酵母細(xì)胞快速冷凍至-196℃，然后分批慢速復(fù)溫至不同溫度，再快速復(fù)溫，分別測定細(xì)胞存活率。Bank(1970)將酵母細(xì)胞快速冷凍至-196℃，然后分批慢速復(fù)溫至不同溫度，再快速冷凍至-100℃，分別進(jìn)行低溫電鏡觀察再結(jié)晶情況。結(jié)論：快速冷卻過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)冰本身對細(xì)胞并非致命的損傷，但若在復(fù)溫過程中速率過慢，使胞內(nèi)冰再結(jié)晶，則對細(xì)胞的損傷是致命的；如果采取快速復(fù)溫仍可能使細(xì)胞有教高存活率。復(fù)溫速率越快越好嗎？2.10造成損傷的其他因素抗凍劑的種類、濃度及加