環(huán)境中微生物的檢測和分離純化

生72伍國羽2007012357 環(huán)境中微生物的檢測和分離純化生72伍國羽2007012357組別周四班2-1-1實驗同組人：王甦實驗時間2010年4月16日實驗?zāi)康氖煜こＳ梦⑸锱囵B(yǎng)基配制與滅菌方法和原理;掌握微生物的分離,純化;用平板劃線法和稀釋法分離微生物;認識微生物存在的普遍性，理解無菌操作原理.實驗原理微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各種微生物生長繁殖的大本營?？諝饫飸腋≈鵁o數(shù)細小的塵埃和水滴，它們是微生物在空氣中的藏身之地。各種水域中也有無數(shù)的微生物。居民區(qū)附近的河水和淺井水容易受到各種污染，水中的微生物就比較多。大湖和海水中，微生物較少。從人和動植物的表皮到人和動物的消化道，也都經(jīng)常生活著大量的微生物。平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌數(shù)。實驗器材實驗材料:菌源:土樣10g，大腸桿菌；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基24個；實驗儀器:取液器:1000ul、200ul各一支，培養(yǎng)箱；實驗試劑:0.9%無菌生理鹽水，250ml三角瓶中裝99ml生理鹽水，每瓶加約20粒玻璃珠；250ml三角瓶中99ml生理鹽水，作100倍稀釋用。實驗用具：平皿，涂棒，無菌200ul，1000ul吸頭，記號筆，酒精燈。實驗步驟采土樣：選擇肥沃土壤,去表層土,挖5~20cm深度的土壤數(shù)10g,裝入燒杯,帶回實驗室;制備土壤稀釋液;稱取土樣1.0g，放入盛99ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用手振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。(全班統(tǒng)一做1份,分到每個小組1ml)。用200ul的無菌吸頭從中吸取0.1ml土壤懸液，注入事先分裝有0.9ml無菌水的試管中，吹吸3次，搖勻（10-3）。類推制得10-4、10-5、10-6的土壤懸液。涂布。用無菌吸頭，分別吸取10-6、10-5、10-4濃度土壤稀釋液100ul，較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板，編號為1、2、3。涂板。單菌落劃線（2塊）：用接種環(huán)挑取大腸桿菌液，做單菌落劃線分離，每人2板。手指（1塊）：分別用未洗過的手指頭,用自來水打濕的手指頭，用自來水洗過的手指頭，用洗手液洗過的手指頭(不用毛巾擦)在同一平板的不同分區(qū)涂抹（用力一致）。頭發(fā)（1塊）：放置一根頭發(fā)，用無菌圖布棒壓緊在培養(yǎng)基上?？諝猓?塊）：打開培養(yǎng)皿置實驗臺上（空氣中）10min，按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋1min。豆?jié){（1塊）：用永和豆?jié){涂板。泡菜水（1塊）：用前次實驗制作泡菜的腌制水涂板。培養(yǎng)。將牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于35℃溫箱中培養(yǎng)24h；統(tǒng)計所長出的菌落數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果實驗結(jié)果與討論土壤中微生物計數(shù)。實驗結(jié)果如下表1所示：表1土壤稀釋液微生物計數(shù)結(jié)果稀釋濃度菌落數(shù)平均值微生物濃度（個/g土壤）12310-418無法計數(shù)無法計數(shù)181.8X10610-5無法計數(shù)7無法計數(shù)70.7X10710-630無法計數(shù)1.51.5X107實驗得到的菌落數(shù)較少，都偏離300太多，故誤差較大，三組得到的結(jié)果差別比較大。由于天氣尚寒冷，土壤中菌量還比較少，應(yīng)該使用更濃的土壤溶液涂板觀察計數(shù)。實驗中發(fā)現(xiàn)大部分平板都無法計數(shù)，菌落部分長成了一片或者長得有較多菌落連在一起。這是涂板沒有涂勻的結(jié)果。實驗中使用的平板是新倒上凝結(jié)即時使用的，故含水量比較多，菌液滴加到培養(yǎng)基上不容易被培養(yǎng)基吸收，故涂板涂了很久之后依然有液體依附在培養(yǎng)基表面和涂布棒上，這樣長出來的菌就會形成一片的菌斑。而如果菌液剩余不多，粘附在涂布棒上，當(dāng)將涂布棒拿離培養(yǎng)基的時候就會留下一條菌液痕，會長出條狀的菌斑。建議實驗改進為提前一天由助教倒好一半數(shù)量的平板，課堂上同學(xué)們學(xué)習(xí)倒另一半數(shù)量的平板使用，這樣也可以對比看到含水量較多的平板和含水量較少的平板的區(qū)別。單菌落劃線圖1.大腸桿菌單菌落劃線。用接種環(huán)挑取大腸桿菌液，做單菌落劃線分離，可以看到在菌液越來越少，在第四次劃線時出現(xiàn)了單菌落。手指細菌測試圖2.手指上細菌測試。分別用未洗過的手指頭（1區(qū)）,用自來水打濕的手指頭（4區(qū)），用自來水洗過的手指頭（2區(qū)），用洗手液洗過的手指頭（3區(qū)）(不用毛巾擦)在同一平板的不同分區(qū)涂抹（用力一致）。（注意標號是反的）可以看到未洗過的手指頭涂抹的區(qū)域菌落最少；用水打濕后菌落稍微有幾個；用自來水洗過的手指頭菌落密度和用洗手液洗過的幾乎一樣，菌落都非常多，而且有兩種，一種為白色，一種為黃色菌落。這并不表明沒洗過的手指頭最干凈。由于沒有水，所以干的指頭上的菌很難落下來到平板上，所以細菌都還粘在手指上。用水沾濕后會有少量的細菌脫落下來。而用水洗和用洗手液洗下的菌的密度相當(dāng)。單就細菌來講，如果手上沒有明顯的污垢，用清水清洗會比用洗手液洗更健康，因為洗手液里的化學(xué)物品會傷害皮膚。同時，洗手后應(yīng)該把水擦干更健康。頭發(fā)細菌測試圖3.頭發(fā)上細菌測試。放置一根頭發(fā)，用無菌圖布棒壓緊在培養(yǎng)基上?？梢钥吹筋^發(fā)上的細菌不算很多，只有幾個菌落。發(fā)現(xiàn)不管用桌子的黑底或者白紙的白底，都沒法將非常小的菌落拍的太清楚，而且如果相機里板子太遠會沒法拍清楚，離得太近又擋光，依然拍不清楚很小的菌落。而且非常容易拍到燈光的高光點，導(dǎo)致看不清菌落。實驗中發(fā)現(xiàn)將平板豎起來，以白紙為背景但又不貼著白紙的時候可以將小菌落拍的非常清楚，而且此時相機與平板在一個水平線上，不會擋住平板的光線，這樣即使有高光點也依然能拍到菌落的陰影，看的非常清楚。空氣中落菌情況圖4.空氣中細菌含量的測定。打開培養(yǎng)皿置實驗臺上（空氣中）10min，然后培養(yǎng)過夜看平板上長菌情況?？梢钥吹酱蜷_了10分鐘后平板上落菌量并不多。說明實驗室的空氣細菌比較少。按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋1min。此塊平板未長菌，說明實驗中所使用的無菌操作方法是可行的。永和豆?jié){中細菌測定。用100ul永和豆?jié){涂板后培養(yǎng)觀察其平板菌落情況。實驗中此塊平板未長菌。說明永和的豆?jié){衛(wèi)生狀況非常好。但有的同學(xué)做的出來的用豆?jié){涂的平板長滿了菌落，這有可能是由于他們使用豆?jié){涂板的時間比較晚，豆?jié){已經(jīng)涼了放置了過長時間，里面已經(jīng)開始生長細菌了。本組實驗使用的豆?jié){都是熱的很新鮮，做了2塊平板用豆?jié){涂板都沒有長菌。泡菜水中細菌含量的測定。圖5.泡菜水中細菌含量的測定。用100ul泡菜水涂板后培養(yǎng)觀察其平板菌落情況?？梢园l(fā)現(xiàn)平板上的菌落都比較小，但數(shù)量比較多。但在制作泡菜時為無氧發(fā)酵，所以這些好氧菌即使在瓶口處的泡菜水中少量存在也不會繁殖，故不會影響泡菜的質(zhì)量。思考題你所取的土壤中細菌數(shù)量級為多少？土壤中細菌數(shù)量級為107。從你周圍環(huán)境中微生物的觀察,你認為無菌操作應(yīng)注意什么?無菌操作暴露無菌部分在空氣中的時間必須要短，暴露時需在酒精的的火焰旁邊。注意有菌的部分盡量不要接觸到無菌的部分。實驗前需洗手并且擦干。進行接種、劃線和涂布操作的前后涂布棒和接種環(huán)應(yīng)在火焰上徹底滅菌，涂布時在酒精燈火焰處操作，打開培養(yǎng)皿的程度要盡可能小，涂棒能夠伸入涂勻即可。倒培養(yǎng)基時打開培養(yǎng)瓶后瓶口需在酒精燈上略加灼燒。說明飯前洗手,飯后刷牙的重要性;從本次實驗中看到手上存在大量微生物，其中有對人體有害的致病菌，而殘存在牙縫中的牙垢也適宜微生物生長。洗手、刷牙可使清除手上微生物和牙垢，防止有害微生物在手上大量存在或在牙齒縫隙中大量生長，非常重要。在日常生活中如何講究飲食衛(wèi)生?飯前洗手,飯后刷牙，食物清洗干凈；餐具定期進行消毒；不食用過期或者因長期存放可能已經(jīng)被污染的食品，生、熟食分開存放，分刀具、砧板操作，生食要清洗干凈，熟食要加熱徹底等等試解釋夏天時煮好的飯如果放在鍋中保持蓋著鍋蓋不動，不容易變質(zhì)，而一旦盛在碗里的飯就容易變質(zhì)，如果是吃剩的剩飯就最容易變質(zhì)的原因。蒸煮過的飯中不少細菌已經(jīng)被殺滅，在不開鍋蓋的情況下，和外界基本隔離，所以不容易受到外界環(huán)境中微生物的污染，因而不容易變質(zhì)。盛在碗里，和外界環(huán)境直接接觸，就容易被空氣中的細菌污染，容易變質(zhì)；吃剩的飯之前與人的唾液、餐具均有長時間接觸，已經(jīng)含有大量、多種微生物，變質(zhì)速度最快。根據(jù)實驗結(jié)果，試批駁“潔僻行為”。從本次實驗的結(jié)果來看，我們?nèi)粘Ｉ钏幍沫h(huán)境中含有各種各樣的微生物，即便是在洗的非常干凈的手或者器物上，都含有大量的微生物。不論采取多么小心的衛(wèi)生習(xí)慣，也不可能完全清除或者殺滅這些細菌，在正常情況下，由于人體本身的免疫系統(tǒng)具有較強的抵御能力，這些微生物的存