水產(chǎn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

水產(chǎn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一微生物基本操作技術(shù)（2學(xué)時(shí)）一、教學(xué)目標(biāo)與基本要求掌握微生物實(shí)驗(yàn)中常用的基本操作二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題1、玻璃器皿清洗和包裝有哪些注意事項(xiàng)？2、細(xì)菌接種時(shí)有哪些注意事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌形態(tài)觀察(2學(xué)時(shí))一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握無(wú)菌操作技術(shù)2、掌握細(xì)菌涂片的制作技術(shù)；3、掌握顯微鏡特別是油鏡的原理和使用方法；4、掌握生物科學(xué)繪圖的方法。二實(shí)驗(yàn)器材1、器材：香柏油、油鏡洗液、顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、小滴管、培養(yǎng)皿、酒精燈。2、培養(yǎng)基和試劑：金黃色葡萄球菌和大腸桿菌斜面菌種。三操作步驟

1、細(xì)菌涂片的制作(1)取菌用無(wú)菌操作取菌。(2)涂片將帶菌的液滴涂均勻。應(yīng)先在載玻片中央滴一滴生理鹽水或蒸餾水，然后用接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合，均勻涂抹成適當(dāng)大小的薄層。（無(wú)菌操作）(3)干燥涂片最好在室溫中自然干燥，必要時(shí)，可將標(biāo)本面向上，在火焰高處烘干，切勿靠近火焰，以免標(biāo)本干焦、菌體變形。(4)火焰固定將已干燥的標(biāo)本片涂面向上，使背面在酒精燈火焰上以鐘擺速度通過三次，使固定后的標(biāo)本片觸及皮膚時(shí)的稍感燒燙為度，但決不能在火焰上燒烤，否則，菌體形態(tài)毀壞。2．顯微鏡觀察

(1)低倍鏡觀察將標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器使觀察對(duì)象處在物鏡的正下方。用4X或10X物鏡觀察找到合適的觀察目標(biāo)。

(2)高倍鏡觀察在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，換用40X觀察。(3)油鏡觀察在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。將聚光器升至最高位置并開足光圈，若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過1.0，還應(yīng)在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達(dá)到最大的效能。調(diào)節(jié)照明使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。3、生物科學(xué)繪圖繪圖時(shí)用鉛筆以線條構(gòu)成物體大約輪廓，或以“點(diǎn)”來(lái)表現(xiàn)物體，組成畫面；或者在用線條構(gòu)成物體的輪廓后，再用“點(diǎn)”的疏密來(lái)表現(xiàn)組織物體的層次結(jié)構(gòu)緊密等。實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、繪制油鏡下觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)菌形態(tài)。2、思考題涂片為何要固定？固定加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)怎樣？使用油鏡時(shí)，為什么必須用香柏油？一、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)基本與要求

1、明確培養(yǎng)基的配制原理。

2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、介紹培養(yǎng)基的配制原理和方法步驟

2、動(dòng)手稱量試劑、配制牛肉蛋白胨培養(yǎng)基等。實(shí)驗(yàn)三

培養(yǎng)基的制備三、實(shí)驗(yàn)材料三實(shí)驗(yàn)器材1、溶液或試劑：牛肉膏，蛋白質(zhì)，NaCl，瓊脂，1mol/LNaoH，1mol/LHCl；2、儀器或其他用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)其也裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，PH試紙（PH5.5-9.0），棉塞，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4-7.6固體培養(yǎng)基：添加1.5-2%瓊脂半固體培養(yǎng)基：添加0.5%瓊脂四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、培養(yǎng)基的配制：同學(xué)們先將試管貼好標(biāo)簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標(biāo)簽粘貼位置在離管口1/3管身處。注意：標(biāo)簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時(shí)蒸汽模糊字跡。

操作圖示：稱量--配置--調(diào)節(jié)pH值--過濾--分裝--滅菌

1.稱量

按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于燒杯中。對(duì)于不是粉狀（如肉膏），應(yīng)用燒杯稱量。

2.配調(diào)

向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶解（可加熱助溶）。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化時(shí)，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所失水分。

3.調(diào)節(jié)pH值

培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫時(shí)用pH試紙測(cè)pH，然后根據(jù)要求加酸或堿（一般用1molHcl和1molNaOH），要緩慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然pH時(shí)，不用調(diào)節(jié)。

4.過濾

用濾紙或多層紗布過濾，一般無(wú)特殊要求可省去。

5.分裝

將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱裝。分裝時(shí)要避免培養(yǎng)基粘染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為下面幾方面：

（1）斜面：裝量為管長(zhǎng)的1/4-1/5。

（2）液體培養(yǎng)基、高層培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基：裝載量不超過管長(zhǎng)的1/3。

（3）三角瓶：裝量不超過容積1/2。6.滅菌

塞棉塞，包扎，滅菌。

高壓蒸汽滅菌法：是在密閉的加壓容器內(nèi)進(jìn)行，加熱使器內(nèi)的水產(chǎn)生蒸汽，由于密閉，增加了器內(nèi)的壓力，使水的沸點(diǎn)升高，從而獲得高于100度的蒸汽溫度。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。五、問題和思考

l．配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無(wú)菌檢查?實(shí)驗(yàn)四

微生物接種技術(shù)一、教學(xué)目標(biāo)與基本要求：掌握各種微生物接種的基本操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1．斜面接種

2．液體接種

3．穿刺接種

4．平板接種三、實(shí)驗(yàn)步驟將有菌的材料或純粹的菌種轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌的培養(yǎng)基上，這個(gè)過程就稱為接種。常用的幾種方法如下：斜面接種液體接種穿刺接種平板接種1.斜面接種：從已長(zhǎng)好微生物的菌種管移接到另一斜面管的方法。此法用于好氣性微生物的接種。左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平。用右手先將棉塞擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)，用右手的小指、無(wú)名指和手掌撥下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上燃燒一圈，接種環(huán)灼燒滅菌后插入管內(nèi)，冷卻、挑菌，立即轉(zhuǎn)入斜面管底部，沿斜面劃曲線或直線。斜面接種示意圖2.液體接種：由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。操作與上法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，再輕輕搖動(dòng)均勻，即可培養(yǎng)。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種。3.穿刺接種：用接種針挑取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厭氣性細(xì)菌接種、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。4.平板接種：將菌種接至培養(yǎng)皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，活菌計(jì)數(shù)以及在平板上進(jìn)行各種試驗(yàn)時(shí)采用的一種接種方法，可分為下面幾種：

1)斜面接平板a.劃線法：見平板劃線分離法。b.點(diǎn)種法：一般用于觀察霉菌和酵母細(xì)胞，輕輕點(diǎn)在平板的表面（根霉點(diǎn)一點(diǎn)，曲霉、酵母可點(diǎn)3-4點(diǎn)）即可。

2)平板接斜面：一般是將經(jīng)平板分散培養(yǎng)得到的單菌落接種到斜面，以便作鑒定或擴(kuò)大培養(yǎng)、保存之用。

四、問題和思考1.稀釋分離時(shí)，為何要將融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，才倒入裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)？2.接種時(shí)，為何要盡量使試管平放？實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌常用染色方法（2學(xué)時(shí)）一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、鞏固已學(xué)細(xì)菌涂片技術(shù)；2、掌握細(xì)菌簡(jiǎn)單染色技術(shù)；3、掌握革蘭氏染色技術(shù)，并學(xué)習(xí)報(bào)告革蘭氏染色的結(jié)果。二實(shí)驗(yàn)器材1、器材：香柏油、油鏡洗液、顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、小滴管、培養(yǎng)皿、酒精燈。2、培養(yǎng)基和試劑：金黃色葡萄球菌和大腸桿菌斜面菌種；待測(cè)菌1-2種；美藍(lán)染色液；革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、魯戈氏碘液、95%乙醇、番紅復(fù)染液）。三操作步驟

1、細(xì)菌涂片的制作操作步驟同實(shí)驗(yàn)二。2、簡(jiǎn)單染色法只應(yīng)用一種染料進(jìn)行染色的方法。如美藍(lán)染色法。美藍(lán)染色法：在已干燥、固定好的涂片上，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹物即可）美藍(lán)染色液，經(jīng)1-2分鐘，水洗、瀝去多余的水分，吸干或自然干燥鏡檢。3、革蘭氏染色法(1)在已干燥、固定好的涂抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，將菌膜覆蓋為宜，經(jīng)1-2分鐘，水洗。(2)甩去殘水，滴加碘液染1-3分鐘，水洗。(3)脫色：滴加95%酒精2-3滴，頻頻搖晃3-5秒鐘，使酒精能均勻布滿涂面，斜持玻片使酒精流出，再滴加酒精，直至流下的酒精無(wú)色或稍呈淡紫色為止，之后水洗。脫色的時(shí)間，可根據(jù)涂抹片的厚度靈活掌握，通常在15-40秒之間。(4)滴加番紅復(fù)染液復(fù)染1-2分鐘，水洗。(5)用吸水紙吸干或自然干燥、鏡檢。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。(6)按上述方法，在同載玻片上，在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作混合涂片染色鏡檢進(jìn)行比較。（陽(yáng)性紫色，陰性紅色）四作業(yè)1、分析幾種細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果，陽(yáng)性或者陰性？2、分析革蘭氏染色過程中的注意事項(xiàng)有哪些？決定革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間。如脫色時(shí)間過長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌。反之，革蘭氏陰性菌也可以誤認(rèn)為陽(yáng)性菌，脫色時(shí)間長(zhǎng)短又受涂片之厚薄、脫色時(shí)玻片搖晃的快慢及酒精用量多少等因素的影響，無(wú)法嚴(yán)格規(guī)定，一般可用已知的革蘭色陽(yáng)性菌和陰性菌作對(duì)照，可驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)備性。在染色過程中不可使染色液干涸。選用適齡培養(yǎng)物，以培養(yǎng)18-24小進(jìn)為宜，菌齡過長(zhǎng)，由于細(xì)菌死亡或自溶也常使革蘭氏陽(yáng)性菌呈陰性反應(yīng)。涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)六理化因素對(duì)微生物的影響（2學(xué)時(shí)）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解紫外線對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。2．了解化學(xué)藥劑對(duì)微生物的作用。3．學(xué)習(xí)抑菌圈的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)器材1．器材：30W紫外燈、尖頭鑷子、無(wú)菌培養(yǎng)皿、玻璃刮鏟、酒精燈、無(wú)菌圓形濾紙片、滅菌黑紙、1mL的無(wú)菌吸管、5rnL無(wú)菌水試管、恒溫培養(yǎng)箱。2．培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨營(yíng)養(yǎng)瓊脂。3．菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等液體菌種。4．藥劑：0.1%HgCl2、0.5%AgNO3、0.5%CuSO4、5%石炭酸。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）紫外線對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響1．將營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成平板；2．用無(wú)菌吸管吸取0.1mL培養(yǎng)18h左右的金黃色葡萄球菌菌液分別放入4個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用無(wú)菌玻璃刮鏟涂布均勻；3．在無(wú)菌操作下，用鑷子取小塊無(wú)菌牛皮紙放在平皿涂菌的表面遮住部分平板，把培養(yǎng)皿放在紫外燈下10-20cm處的臺(tái)面，打開皿蓋，4個(gè)平板置紫外燈下分別照射1min、5min、10min和20min；4．然后關(guān)上紫外燈光，并用消毒鑷子取出牛皮紙，再蓋好皿蓋，置于37℃遮光培養(yǎng)24h即觀察結(jié)果。5．貼黑紙?zhí)幱屑?xì)菌生長(zhǎng)，紫外線照射處無(wú)菌生長(zhǎng)。（二）化學(xué)藥劑的抑菌、殺菌作用1．制平板取融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂按無(wú)菌操作方法，分別傾入4套無(wú)菌培養(yǎng)皿中，制成平板。2．制菌懸液：取5mL無(wú)菌水試管，按無(wú)菌操作方法倒入金黃色葡萄球菌菌種斜面，制成菌懸液，同法將大腸桿菌制成菌懸液。3．接種：取無(wú)菌吸管1支，吸取少量葡萄球菌菌懸液，向第一個(gè)培養(yǎng)皿平板上滴1-2滴，再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板表面涂布均勻，然后在皿蓋上注明菌別。同樣，將大腸桿菌菌懸液注入不同的平板上，并均各用無(wú)菌玻璃刮鏟涂抹均勻。4．放藥片：用無(wú)菌尖頭鑷子將分別沾有0.1%HgCl2、0.5%AgNO3、0.5%CuSO4和5