胚胎移植課件

動(dòng)物克隆研究現(xiàn)狀及其展望一、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

（一）概述

動(dòng)物胚胎工程是當(dāng)今生物工程的研究熱點(diǎn)之一，目前主要向兩頭延伸：胚胎工程推廣應(yīng)用高深研究（胚移產(chǎn)業(yè)化）（克隆、轉(zhuǎn)基因）

分子克?。喝斯U(kuò)增生物大分子

克隆（Clone）細(xì)胞克?。杭?xì)胞系

（無(wú)性繁殖）

胚胎細(xì)胞克隆

個(gè)體克隆（卵核移植）

體細(xì)胞克隆克隆源于希臘文，原意為樹(shù)木的枝條，在生物學(xué)中系指一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細(xì)胞或一群個(gè)體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱(chēng)為無(wú)性繁殖系。細(xì)胞核移植技術(shù)：將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過(guò)精子穿透等有性過(guò)程即無(wú)性繁殖就可被激活、分裂并發(fā)育成新的個(gè)體、使得核供體的基因得到完全復(fù)制。（二）哺乳動(dòng)物胚細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞克隆重大進(jìn)展技術(shù)基本成熟：如1枚牛胚獲得了7頭活牛犢。繼代克?。号＿B續(xù)克隆至第7代，獲得了第3代犢牛，1枚胚連續(xù)克隆獲得了190枚胚胎；山羊繼代克隆5代共獲得了45只不同代的后代，1枚胚連續(xù)克隆獲得了298枚胚胎。（類(lèi)）胚胎干細(xì)胞系的建立：僅在小鼠上建立了ES系（Evans&Kaufman,1981;Martin,1981），意義很大，可用ES細(xì)胞進(jìn)行核移植。1995年，英國(guó)學(xué)者Campbell等，利用9.5天綿羊胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)傳3代后作為核供體獲得了后代，曾被評(píng)為96年世界十大科技新聞之一。1999年，小鼠ES細(xì)胞克隆獲得成功（Wakayamaetal.,1999），用長(zhǎng)期培養(yǎng)的牛PGCs克隆后獲得了一頭公牛（Muelleretal.,1999）。（三）體細(xì)胞克隆進(jìn)展成年體細(xì)胞：綿羊Dolly，乳腺上皮細(xì)胞，Wilmutetal.(1997)；小鼠30余只，卵丘細(xì)胞，Wakayamaetal.(1998)；牛，卵丘細(xì)胞（5），輸卵管上皮（3），Katoetal.(1998)；老牛顆粒細(xì)胞（2），傳代凍解，Wellsetal.(1998)；乳腺上皮原代細(xì)胞（1）與耳皮膚成纖維細(xì)胞（1），Zakhart-chenkoetal.(1999)；肌肉細(xì)胞（4），傳4代，Shigaetal.(1999)；耳皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3個(gè)月傳15代，Kubotaetal.(2000)；山羊，張涌等（2000）；成勇等（2000）；Keeferetal.(2000)。豬，顆粒細(xì)胞核移植胚二次核移植，Polejaeveaetal.(2000)。胎兒成纖維細(xì)胞：綿羊，3只，Wilmutetal.(1997）；6只，Schniekeetal.(1997）；牛，Cibellietal.(1997);；Butler(1998)；Zakhartchenkoetal.(1999)；Vignonetal.(1999)；山羊，Baguisietal.(1999)；豬，Onishietal.(2000)。（四）哺乳類(lèi)異種動(dòng)物克隆研究進(jìn)展指核供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞來(lái)源于兩個(gè)不同的種系。研究報(bào)導(dǎo)不多。尚未見(jiàn)有異種克隆個(gè)體產(chǎn)生的報(bào)導(dǎo)，但有一些獲得異種克隆囊胚甚至胎兒的報(bào)導(dǎo)。大熊貓成年體細(xì)胞與去核兔卵母細(xì)胞重建得到了異種體細(xì)胞克隆囊胚（陳大元等，1999）。二、動(dòng)物克隆的技術(shù)路線（一）供體核的分離技術(shù)1.胚細(xì)胞用0.2%鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎,然后機(jī)械法剝離透明帶,鈍頭玻璃吸管反復(fù)吹吸以分離成單個(gè)卵裂球。2.體細(xì)胞最早是用青蛙腸粘膜上皮細(xì)胞的核獲得后代。Wilmut等將綿羊乳腺細(xì)胞在特定的實(shí)驗(yàn)條件下增殖培養(yǎng)6天，誘使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，以便染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)整和核進(jìn)行重組，從而獲得了克隆綿羊“多莉”，開(kāi)創(chuàng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植（克?。┑男录o(jì)元。（二）受體細(xì)胞的去核技術(shù)現(xiàn)一般均采用超數(shù)排卵回收的卵母細(xì)胞或體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞，并將其置于含細(xì)胞松弛素B和秋水仙胺的培養(yǎng)液中，一端用固定吸管固定，另一端用一尖頭吸管（Ф30μm）穿透透明帶進(jìn)入卵周隙，或用一細(xì)長(zhǎng)玻璃針刺破并切開(kāi)一部分透明帶，再用呈直角的去核吸管經(jīng)切囗抵住細(xì)胞膜，操縱去核吸管，從第1極體外吸除第一極體及時(shí)性于分裂中期的染色體和周?chē)牟糠旨?xì)胞質(zhì)。（三）核卵重組技術(shù)在顯微操作儀操縱下，用去核吸管吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去除核的受體卵母細(xì)胞的卵周隙中。（四）重組胚的融合技術(shù)由于微吸管破壞了卵膜及一部分細(xì)胞質(zhì)，若直接移植則成功很低，故需對(duì)重組胚進(jìn)行融合，現(xiàn)多采用電融合法,將重組胚置于融合小室內(nèi)，使核一質(zhì)集結(jié)面與電極相平行，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，給予一定時(shí)間的矩型直流電脈沖促使其融合。（五）核移植胚的培養(yǎng)與移植或重復(fù)克隆技術(shù)融合后的胚胎在體外培養(yǎng)或經(jīng)過(guò)中間受體培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚，然后移入與胚齡同期的受體動(dòng)物子宮角內(nèi)，可望獲得克隆后代。獲得的早期胚也可作為供體核重新克隆。三、意義及發(fā)展前景（一）意義為動(dòng)物胚胎發(fā)生、死亡及其調(diào)控以及人的生長(zhǎng)、衰老等研究提供研究手段。為許多研究如肝癌等提供大量遺傳性狀一致的動(dòng)物模型。提供人體代用器官或生產(chǎn)大量生物藥品。優(yōu)秀種畜的快速純繁擴(kuò)群，加快新品種選育的進(jìn)程。拯救珍貴瀕危動(dòng)物。（二）發(fā)展前景進(jìn)展快、意義大，但還有許多問(wèn)題有待解決，仍是當(dāng)今生物界研究的熱點(diǎn)。2000年武漢動(dòng)物繁殖研討會(huì)上，眾多專(zhuān)家認(rèn)為，十五期間，在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的同時(shí)，克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞等研究將會(huì)有更大的進(jìn)展，建議并相信國(guó)家會(huì)有更大強(qiáng)度的資助。

四、我們實(shí)驗(yàn)室擬開(kāi)展的

研究工作

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心去年底借搬遷實(shí)驗(yàn)室之際，我們對(duì)原有的胚胎室進(jìn)行了擴(kuò)充，面積達(dá)到了100M2，并為克隆預(yù)留了無(wú)菌室。利用學(xué)校貸款新添置了CO2培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、電子天秤等儀器。最近校長(zhǎng)投資50萬(wàn)元用于購(gòu)置顯微操作系統(tǒng)等。最近學(xué)校正式成立校級(jí)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心，并在為下一步申請(qǐng)成立省級(jí)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)作準(zhǔn)備。目前本中心直接從事胚胎工程研究的人員有4名教師與近10名研究生。（一）胚胎干細(xì)胞系的建立胚胎干細(xì)胞具有全能性與無(wú)性繁殖兩大特點(diǎn)，為克隆動(dòng)物無(wú)限量地提供種質(zhì)資源。早在80年代初世界上就已建立了小鼠ES細(xì)胞系，但其它一些動(dòng)物只是建立了類(lèi)ES細(xì)胞系。這次全國(guó)動(dòng)物繁殖研討會(huì)上，專(zhuān)家一致認(rèn)為，攻克并建立ES細(xì)胞系已迫在眉睫。我們實(shí)驗(yàn)室已有多年從事胚胎與細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)，以此為出發(fā)點(diǎn)，近期先建立類(lèi)ES細(xì)胞系是完全可能的。（二）體細(xì)胞克隆的研究

克隆的目的在于大量繁殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的良種或稀有動(dòng)物。我們選擇以名犬或種羊?yàn)閷?duì)象，其數(shù)量少、價(jià)值高，不僅科學(xué)上有突破意義，而且為將來(lái)開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。南京警犬研究所是公安部直屬的、集警犬科研與養(yǎng)殖的大型研究所，可以為該項(xiàng)研究提供寶貴的種質(zhì)資源。種羊可選用波爾山羊或綿羊無(wú)角道賽特等。目前先開(kāi)始用兔作試驗(yàn)。

注核

移植

一群名犬或種羊

名犬或種羊克隆示意圖卵母細(xì)胞

去核

去核卵母細(xì)胞

皮膚組織皮膚細(xì)胞體外傳代

五、關(guān)于克隆人的問(wèn)題

一、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

早在100多年前就進(jìn)行過(guò)體外受精嘗試；

1951年，精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，是體外受精的里程碑；

50—70年代，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行了大量研究，并取得了成功；

80年代以來(lái)，由于對(duì)胚胎需求量的加大，促進(jìn)了家畜體外受精的研究，牛、綿羊、山羊、豬等相繼獲得了成功，國(guó)內(nèi)在90年代也在家畜上取得了成功。

現(xiàn)已將卵母細(xì)胞體外成熟—體外受精—早期胚體外發(fā)育，甚至冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的胚胎。

二、卵巢卵母細(xì)胞的獲得與體外成熟培養(yǎng)

（一）卵巢卵母細(xì)胞的獲得1.活體卵巢上采集

母畜超排處理后，利用剖腹術(shù)或腹腔鏡技術(shù)已能成功地采集卵泡卵母細(xì)胞。2.屠宰后卵巢上采集

(1)卵巢的采集與保存:宰后立即無(wú)菌采集,30--37度滅菌生理鹽水中6H內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

(2)卵巢表面卵泡細(xì)胞的獲得

1)抽取法:18號(hào)針頭;最常用;

2)剝離法:

3)切開(kāi)法:3.卵巢內(nèi)卵泡卵母細(xì)胞的獲得

數(shù)量多，用一組特制刀片對(duì)卵巢組織進(jìn)行深部切割，采卵率約提高1倍。

（二）卵母細(xì)胞的篩選

只有周?chē)恢暾亚穑ˋ級(jí)）或部分卵丘脫落（B級(jí)）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。

（三）卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)1.成熟培養(yǎng)液與培養(yǎng)條件

最常用的是碳酸氫鈉或Hepe’s緩沖的TCM-199;

5%CO2、飽和濕度、38.5--39度，24H。2.成熟培養(yǎng)中添加成分的影響

1)促性腺激素與E2的影響

2)EGF的影響

3)顆粒細(xì)胞的影響:低濃度能促進(jìn)成熟分裂

4)血清的影響

三、牛精子的體外獲能與體外受精

（一）精子的洗滌與體外獲能1.BO液類(lèi)

鮮精或凍精解凍后離心洗滌約2次,每次5-10分鐘,最后的精子小滴懸浮成1-10X106/ML。

常用咖啡因-肝素-BSA使精子獲能。2.改良Tyrode液（TALP）類(lèi)

1）上浮法

2）Percoll法

（二）體外授精授精通常在覆蓋下的微滴中進(jìn)行，微滴以50--100微升為宜，一般每滴中加5--10個(gè)卵母細(xì)胞，精子最終濃度為0.64--1X106個(gè)/ML5%CO2、39度培養(yǎng)，BO液中6-8H，TALP液中18-24H。

四、其它哺乳動(dòng)物精子的體外獲能與體外受精特點(diǎn)（一）豬鮮精或凍精用0.9%氯化鈉-1mg/mlBSA洗3次，然后用改良臺(tái)氏液或TCM-199液稀釋至108個(gè)/ml、5%CO2、39度獲能孵育60min，最后在受精液（2-10mM咖啡因、10mg/mlBSA）中授精，精子最終濃度為105

個(gè)/ml，條件為5%CO2、39度培養(yǎng)4-5h。（二）山羊Hanada等用鈣離子載體法獲能，受精率達(dá)50%，獲得了世界首例試管山羊。劉靈等用肝素和BSA獲能，受精率最高達(dá)89.7%，并獲得了世界首例卵泡卵母細(xì)胞體外受精后代。

（三）綿羊

方法與牛相似。

五、早期胚的體外發(fā)育

不同的動(dòng)物早期胚胎體外發(fā)育都存在阻斷期，體外發(fā)育培養(yǎng)時(shí)需要一些特殊的培養(yǎng)條件如共同培養(yǎng)細(xì)胞，以克服阻斷，但目前的發(fā)育率仍然比較低，約為40%，是限制體外受精應(yīng)用的一個(gè)突出問(wèn)題。

六、胚胎冷凍保存（一）常規(guī)的慢速冷凍法

冷凍液1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP

冷凍步驟為：①在室溫下，先將牛胚胎放入防凍液中平衡一段時(shí)間；②裝管；③以每分鐘0.3~0.5℃的速度降溫至–35℃；④植冰；⑤平衡10分鐘后，投入液氮中保存。（二）玻璃化冷凍

冷凍液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS

冷凍步驟：首先將胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min后，用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min，然后裝管，封口。把細(xì)管直接投入液氮冷凍保存。

七、影響體外受精的因素（一）卵母細(xì)胞的成熟度（二）精子體外獲能胚胎移植及其意義國(guó)內(nèi)外牛羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展胚胎移植的基本原則胚胎移植技術(shù)路線一、胚胎移植及其意義胚胎移植是指將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭同種且生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體的過(guò)程。實(shí)際上是由產(chǎn)生良種胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工合作共同繁殖后代的技術(shù)。意義：提高良種母畜的繁殖利用率，加快良種純繁速度；加快品種的選育進(jìn)程；代替種畜直接進(jìn)口；拯救瀕危動(dòng)物；研究手段。

二、國(guó)內(nèi)外牛羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展

胚胎移植技術(shù)是20世紀(jì)畜牧業(yè)中繼人工授精技術(shù)之后又一次巨大變革，業(yè)已成為一項(xiàng)充分發(fā)揮優(yōu)良母畜繁殖潛力的實(shí)用繁殖新技術(shù)。國(guó)際間胚胎貿(mào)易非?；钴S，早在1994年，全世界僅胚胎移植牛就已超過(guò)350，000頭，其中進(jìn)出口的胚胎約占總數(shù)的10%，羊胚胎年產(chǎn)總量雖較低，約為牛胚胎的5-10%，但進(jìn)出口比例更高。近年來(lái)，國(guó)際上胚胎的產(chǎn)量和貿(mào)易量則成倍增長(zhǎng)。美國(guó)、加拿大、法國(guó)、新西蘭、澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家成立了上百家胚胎移植公司；美國(guó)、法國(guó)等近年參加后裔測(cè)定的青年公牛中80%以上為胚胎移植的后代。牛羊凍胚移植的成功率達(dá)到了50-60%。我國(guó)的胚胎移植技術(shù)也已相當(dāng)成熟，九五期間，全國(guó)在肉牛、奶牛上分別移植受體4955、3926頭，平均妊娠率達(dá)到51.5%。去年全國(guó)通過(guò)胚胎移植獲得的波爾山羊數(shù)可望達(dá)到800只以上。

三、胚胎移植的基本原則（一）胚胎移植前后所處的環(huán)境應(yīng)是相同或相似的

1．供體和受體在種屬上必須一致

2．供體和受體在生理上必須一致供、受體在發(fā)情時(shí)間上應(yīng)同期化，一般相差不超過(guò)24h，否則移植成功率顯著下降。

3．從供體中收集胚胎的部位與給受體移植胚胎的部位必須一致即從供體子宮角內(nèi)收集到的胚胎應(yīng)該移植到受體的子宮角內(nèi)。（二）移植的時(shí)間要適宜胚胎收集與移植的時(shí)間不能超過(guò)周期黃體的壽命，因此，胚胎的收集時(shí)間不能超過(guò)發(fā)情配種后第7天，最好是在發(fā)情配種后的第5-7天內(nèi)進(jìn)行。

（三）胚胎的發(fā)育應(yīng)當(dāng)正常胚胎的收集及移植過(guò)程應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行，盡量不使其受到物理、化學(xué)或生物方面的影響。同時(shí)，胚胎移植前需進(jìn)行鑒定，確定其發(fā)育正常者才能進(jìn)行移植。

四、胚胎移植技術(shù)路線（一）供、受體的選擇供體的選擇

1．供體應(yīng)是良種，而且為性狀表現(xiàn)優(yōu)秀、具有較高育種價(jià)值的個(gè)體。

2．供體應(yīng)健康無(wú)病，膘情中等偏上，年齡以青壯年為佳，如羊上，可選初產(chǎn)羊及8歲以?xún)?nèi)的經(jīng)產(chǎn)羊作為供體。

3．供體生殖機(jī)能應(yīng)處在較高水平。既無(wú)難產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖病史，也無(wú)子宮卵巢疾病，超排處理前應(yīng)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的正常情期。

受體的選擇

1．受體一般選用價(jià)格低廉、生產(chǎn)性能比較低的同種母畜。

2．受體要具有良好的健康狀態(tài)，體型中上等，初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)青壯年母畜。檢疫和疫苗接種與供體相同。

3．受體應(yīng)具有良好的繁殖性能，既無(wú)難產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖病史，也無(wú)子宮卵巢疾病，移植胚胎前應(yīng)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的正常情期。（二）受體的同期發(fā)情

1.前列腺素處理法PGF2α或其類(lèi)似物有溶解黃體的作用，黃體溶解后，卵巢上就會(huì)有卵泡發(fā)育而發(fā)情，所以只能對(duì)于卵巢上存在黃體的受體有效。在發(fā)情周期的第九天以后，注射PGF2α

，常可在注射后2-3天內(nèi)發(fā)情。在繁殖季節(jié)，如不能確定受體的發(fā)情周期，可采用兩次注射法，受體第1次注射后，凡卵巢上有功能黃體的個(gè)體即可在注射后發(fā)情，選出發(fā)情個(gè)體做為受體。其他間隔10-12天第2次注射。此方法方便可靠，但費(fèi)用較高。2.孕激素處理法孕酮能夠抑制腺垂體釋放FSH，每日肌注或口服孕酮，或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮或其類(lèi)似物，一般處理12-18天后，可以抑制卵泡發(fā)育。停止處理或撤除海綿栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡發(fā)育，從而使受體發(fā)情。通常在停止處理或撤除海綿給后2-3天內(nèi)發(fā)情。為了提高排卵的效率，在孕激素處理結(jié)束的前一天，給予小劑量的FSH是非常必要的。此法費(fèi)用低，但處理時(shí)間長(zhǎng)。(三)供體的超數(shù)排卵與人工授精在母畜（供體）發(fā)情周期的某一時(shí)期，用外源性的促性腺激素處理，從而促使其卵巢上較正常有更多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，并且能夠同時(shí)或準(zhǔn)同時(shí)排出多個(gè)具有受精能力的卵子，這一技術(shù)稱(chēng)為超數(shù)排卵，筒稱(chēng)“超排”。供體羊的超排方案：在發(fā)情周期第10、11、12天每只羊分別肌注FSH100、80、60單位，末次肌注時(shí)同時(shí)注射PG2ML/只，24H后再肌注HCG500單位。發(fā)情后供體配種2—3次。供體牛的超排方案：在發(fā)情周期第10、11、12、13天每頭牛分別肌注FSH160、140、110、90單位，每天分兩次注射，在第12天注射FSH的同時(shí)肌注PG，上午2支/頭，下午1支/頭。發(fā)情后供體配種2—3次。 (四)胚胎的收集1.沖卵液和保存液的制作沖卵液有很多種，目前最常用的為含5%犢牛血清的杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBSS），也可用于體外短期保存胚胎。保存時(shí)間長(zhǎng)或體外培養(yǎng)多用M-199液。D-PBS和M-199液或其他培養(yǎng)液一般都有成品出售。2.羊胚胎的回收(1)術(shù)前準(zhǔn)備場(chǎng)所、器械和人員的準(zhǔn)備供體羊的術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前一日停止喂食但不停水、術(shù)部剃毛；手術(shù)前的麻醉采用硬膜外麻醉結(jié)合局部浸潤(rùn)；術(shù)部皮膚先用2-4%的碘酒消毒，晾干后再用70%—75%的酒精棉涂擦脫碘。將創(chuàng)巾固定在術(shù)部周?chē)⒙冻鲂g(shù)部。

(2)手術(shù)過(guò)程皮膚用外科刀一次切開(kāi)，4—6厘米。肌肉用鈍性分離的方法沿肌纖維的走向分層切開(kāi)，最后切開(kāi)腹膜。切開(kāi)過(guò)程中注意及時(shí)止血。手術(shù)者將食指及中指由切口伸入腹腔觸摸子宮角，用二指夾持，因勢(shì)利導(dǎo)地牽引至創(chuàng)口表面，先循一側(cè)的子宮角至該側(cè)的輸卵管，在輸卵管的末端彎轉(zhuǎn)處找到該側(cè)的卵巢，觀察卵巢表面的排卵點(diǎn)和卵泡發(fā)育情況并做記錄。（3） 沖洗輸卵管法適宜于2--3日齡的胚胎；將一根長(zhǎng)5~7cm，外徑3~4mm的硅膠管插入輸卵管喇叭口內(nèi)1~1.5cm，用血管夾固定。左手掌心向上，以母指和食指捏住子宮角前端，右手持吸有沖卵液的針管并將針頭插入子宮角尖端，注入沖卵液約80—100ML。（4）沖洗子宮法適宜于5--7日齡胚胎；在一側(cè)子宮角中部大彎處用止血鉗尖端刺透子宮壁，插入沖胚導(dǎo)管（二通式醫(yī)用導(dǎo)液管），向?qū)Ч軞饽掖驓?—5ml。在導(dǎo)管頂端前方，向?qū)m管接合部插入套管針，抽出針芯，由此向?qū)m管部緩慢注入沖胚液30—60ml，沖胚液邊注入邊由導(dǎo)管排出，用三角瓶接收回流沖胚液。最后用手指輕輕壓擠子宮角，讓沖胚液完全排出。用同法沖另一側(cè)子宮角。沖胚后將子宮角送回原處，腹腔內(nèi)注入油劑氯霉素5ml，閉合腹壁。術(shù)后肌肉注射氯前列烯醇0.2ml，全身用抗菌素1日。3.牛胚胎的回收適宜于5--7日齡胚胎;

現(xiàn)均采用二通管非手術(shù)采卵法：用直腸把握子宮頸法插入帶有探針的二通管直至一側(cè)子宮角的基部，通過(guò)打氣空注入8--10ML空氣,抽出探針，通過(guò)中心管道反復(fù)注入--回收沖卵液,連續(xù)5--6次。同樣方法沖另一側(cè)子宮角。（五）胚胎的檢查和評(píng)定回收到的沖洗液盛于玻璃器皿中，37℃靜置10分鐘，待胚胎沉降到器皿底部，移去上層液后開(kāi)始檢卵，檢查胚胎發(fā)育情況和數(shù)量多少。在連續(xù)變倍解剖顯微鏡（實(shí)體顯微鏡）下進(jìn)行檢卵。胚胎的質(zhì)量評(píng)定：主要采用形態(tài)學(xué)方法，優(yōu)質(zhì)胚胎才能用于進(jìn)行胚胎冷凍或移植。（六）胚胎的移植羊采用手術(shù)法將胚胎移入輸卵管或子宮角前端。牛采用非手術(shù)法，用移植槍將胚胎移入輸卵管的前端。

胚胎干細(xì)胞（Embryonicstemcells，ES細(xì)胞）是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Innercellmass，ICM）或原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells，PGCs）經(jīng)體外分化、抑制培養(yǎng)、分離和克隆得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。目前，ES細(xì)胞已經(jīng)引起廣大學(xué)者的注意和興趣，對(duì)ES細(xì)胞的研究也取得了很大進(jìn)展。

1.ES細(xì)胞的研究概況

ES細(xì)胞研究，首先源于畸胎瘤細(xì)胞（Teratocarcinomastemcell）或胚胎瘤細(xì)胞（Embryoniccarcinomacell，ES細(xì)胞）。1958年，Steven通過(guò)把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或腎臟被膜下得到了EC細(xì)胞[1]。隨后，EC細(xì)胞常被用以研究哺乳類(lèi)動(dòng)物發(fā)育和遺傳以及細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)各種誘導(dǎo)因子和實(shí)驗(yàn)條件，成功地誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和上皮細(xì)胞等包括三個(gè)胚層在內(nèi)的各種類(lèi)型的分化細(xì)胞。1974年，Brinster把EC細(xì)胞注射到胚泡腔后，EC細(xì)胞參與受體胚胎的發(fā)育，從而得到了嵌合體。1981年，Mintz等培養(yǎng)的METT-1系EC細(xì)胞具有與生殖腺嵌合的能力[2]。但是由于EC細(xì)胞種系間的嵌合率低，僅有13%，而且EC細(xì)胞具有腫瘤源性，生成的嵌合體到了成年又出現(xiàn)腫瘤，建成的EC細(xì)胞系有異常核型。因此EC細(xì)胞作為研究正常細(xì)胞分化的模型并不理想。

1981年，Evans和Kaufman首先在EC細(xì)胞研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)延遲著床的小鼠早期胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，首次分離得到小鼠ES細(xì)胞，并以?xún)蓚€(gè)人名字的開(kāi)頭字母命名為EK細(xì)胞，并建立了ES細(xì)胞系[3]。隨后，人們相繼建立了其它動(dòng)物的類(lèi)ES細(xì)胞。Doetschman(1988)、Piedrahita(1990)建立了倉(cāng)鼠的ES細(xì)胞系。Notarianni(1990)、Piedrakita(1990)、Strojek(1990)、Anderson(1990)和Wheeler(1994)各自成功的建立了豬的類(lèi)ES細(xì)胞系；Sukoyan(1992)建立了水貂的類(lèi)ES細(xì)胞系。Saito(1992)、Strelchenko(1994)和Stice(1993)建立了牛的類(lèi)ES細(xì)胞系，Sims(1993)對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行核移植，得到四頭犢牛，Cibelli用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了生殖系嵌合體牛。Craves(1993)、Niemann(1994)建立了兔的類(lèi)ES細(xì)胞系。Tsuchiya(1994)、Meinecke、Tillmann(1996)建立了綿羊ES細(xì)胞系，Campbel于1996年對(duì)綿羊ES細(xì)胞系進(jìn)行核移植，得到了四只羔羊。Bongso(1994)、Meineke-Tillmann(1996)建立了山羊的類(lèi)細(xì)胞系。1994年，Bonso建立了人的類(lèi)ES細(xì)胞系，1998年，Tillhomoson等建立了人的類(lèi)ES細(xì)胞系，并進(jìn)行了鑒定，其中，H9株傳32代，并能成功地進(jìn)行冷凍和解凍。該細(xì)胞的核型正常，AKP、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-18染色均為陽(yáng)性，體內(nèi)體外分化試驗(yàn)證明具有多能性[4]。

我國(guó)尚克剛（1989，1993，1994），叢笑倩（1990）也分別建立了小鼠的ES細(xì)胞系，并得到了嵌合體小鼠。1991年，陳立人建立了小鼠和豬的類(lèi)ES細(xì)胞系。1995年，賴(lài)學(xué)良建立了兔的ES細(xì)胞系，并得到了一只皮毛嵌合體小鼠。1999年，張學(xué)明對(duì)利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了2日齡到13日齡之間的小鼠胚胎最適于分離小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞[5]

西北農(nóng)業(yè)大學(xué)，從1994年開(kāi)始，用早期胚胎相繼分離克隆出的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳五代（1995，1997，1999）；牛的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳六代（1995，1998，1999）；小鼠的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳九代；1997年用分離流產(chǎn)胎兒原始生殖細(xì)胞克隆出人的類(lèi)ES細(xì)胞，最多傳六代；1999年分離克隆出牛的類(lèi)ES細(xì)胞，傳15代，并進(jìn)行了冷凍保存[6]。特別是近幾年來(lái)，由于對(duì)人的類(lèi)ES細(xì)胞的研究取得了很大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外掀起了一股ES細(xì)胞的研究熱潮。

2.ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及基本特征2.1ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

ES細(xì)胞核大，胞質(zhì)胞漿少，細(xì)胞界限不明顯。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)，邊緣折光性強(qiáng)，集落邊緣可見(jiàn)有少量的已經(jīng)分化為扁平上皮細(xì)胞或梭形的成纖維細(xì)胞。用堿性磷酸酶染色法染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周?chē)某衫w維細(xì)胞則呈淡黃色[7]。小鼠胚胎干細(xì)胞的直徑在7-18um之間，豬、牛和羊的ES細(xì)胞顏色較深，直徑為12-18um[8]。總的來(lái)說(shuō)，ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征。2.2ES細(xì)胞的基本特征

2.2.1全能性

ES細(xì)胞的全能性（totipotenty），是指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力。其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時(shí)空順序依此表達(dá)。ES細(xì)胞是能在體外大量增殖的全能性細(xì)胞，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料。ES細(xì)胞全能性的檢測(cè)方法是以胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植。如果ES細(xì)胞能和去核的細(xì)胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚，而且經(jīng)過(guò)胚胎移植，重構(gòu)胚能發(fā)育形成個(gè)體，則表明ES細(xì)胞具有全能性。例如，Campkell將綿羊的類(lèi)ES細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞中，獲得重構(gòu)。重構(gòu)胚經(jīng)過(guò)胚胎移植，有活的羔羊產(chǎn)生，證明了綿羊的類(lèi)ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性[9]。2.2.2多能性

多能性（Pluripotency）是指ES細(xì)胞具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。細(xì)胞多能性檢測(cè)的方法很多，主要有：1.體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)將ES細(xì)胞培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類(lèi)胚體（Embryoidbodies）。2.將ES細(xì)胞在特定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，定向分化成特定組織。例如，在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素A酸（RA）的培養(yǎng)基可以分化形成體壁內(nèi)胚層。3.將ES細(xì)胞懸液（1-2×107個(gè)/ml）注射入同原動(dòng)物皮下，形成組織瘤，可以形成內(nèi)胚層，中胚層，外胚層。4.胚胎嵌合法，將ES細(xì)胞與胚胎細(xì)胞共同培養(yǎng)或者將ES細(xì)胞注射入囊胚腔中，ES細(xì)胞就會(huì)參與多種組織發(fā)育。如Kaufman首次用小鼠ES與囊胚嵌合，獲得了第一個(gè)生殖腺嵌合體小鼠，表明ES細(xì)胞具有發(fā)育多能性。

利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞或其條件培養(yǎng)液，可誘導(dǎo)ES細(xì)胞在體外分化為造血干細(xì)胞（transforminggrowthfactorB，TGF-B）的ES細(xì)胞，在維甲酸（RA）培養(yǎng)液經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成抑胚體，再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，可見(jiàn)擬胚體周?chē)性S多由內(nèi)皮細(xì)胞排列而成的輻射狀血管樣結(jié)構(gòu)；ES細(xì)胞在RA與雙丁酰基環(huán)腺苷磷酸（dibutyrylcyclicadenosinemonohosphatedBcAmp）共同作用下，可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；在RA誘導(dǎo)下，ES細(xì)胞可分化為肌細(xì)胞；ES或EG細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成的擬胚體在二甲基亞砜（DMSO）、胰島素，三碘腺原氨酸（triiodofhgronine）、胎牛血清或維甲酸（RA）的共同作用下可分化為脂肪細(xì)胞；ROSAB-geo基因傳染的ES細(xì)胞在缺乏G418、含有10%小牛血清，1umol/L低塞米松（dexamethason）條件下可以分化成軟骨細(xì)胞[10]。

此外，也可以通過(guò)測(cè)定時(shí)期專(zhuān)一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigenSSEA）.堿性磷酸酶（AKP）、OCT-4基因、端粒酶（telomerase）等發(fā)育全能性標(biāo)志來(lái)確定。ES細(xì)胞表達(dá)SSEA，因此常用單克隆抗體SSEA-1檢測(cè)ES和EG細(xì)胞表面抗原作為發(fā)育全能性的標(biāo)志。ES和EG等未分化干細(xì)胞具有較AKP高的活性。而在已分化的細(xì)胞中，活性則明顯降低。OCT-4是一種發(fā)育全能性的標(biāo)志基因，在小鼠胚胎發(fā)育早期，生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞都能特異性的表達(dá)OCT-4基因，而分化細(xì)胞則無(wú)OCT-4基因表達(dá)。端粒酶是一類(lèi)核糖糖蛋白，與維持真核細(xì)胞染色體末端的端粒長(zhǎng)度以及控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞端?；钚院芨?，而分化細(xì)胞則一般難以檢測(cè)到其活性[11]。

3.ES細(xì)胞系的建立概況及建系的技術(shù)要點(diǎn)：3.1ES細(xì)胞系的建立概況

迄今為止，小鼠與人的ES細(xì)胞系已經(jīng)成功建立，其他動(dòng)物如倉(cāng)鼠、豬、牛、水貂、兔、山羊的類(lèi)ES細(xì)胞系也相繼建立，在牛、兔上還得到了轉(zhuǎn)基因嵌合體動(dòng)物[12]。

3.2ES細(xì)胞建系的技術(shù)要點(diǎn)

ES細(xì)胞建系的原理是將早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或者是用外科手術(shù)法得到的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Innercellmass，ICM）或者原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells，PGCs）與分化抑制物共同培養(yǎng)，使之增值而又保持未分化狀態(tài)，這樣代代相傳，從而使數(shù)量有限的胚胎或者PGCs細(xì)胞能夠成千上萬(wàn)倍地克隆。其建系的基本技術(shù)要點(diǎn)如下：

3.2.1飼養(yǎng)層的制備及分化抑制物的選擇

常用的飼養(yǎng)層是由小鼠成纖維細(xì)胞無(wú)限系（STO）或小鼠原始胚胎成纖維細(xì)胞（PMEF）制備而成，STO或PMEF經(jīng)過(guò)絲裂霉素C等有絲分裂抑制劑處理后，與早期胚胎或PGCs共同培養(yǎng)后，ES細(xì)胞就可以分離出來(lái)了。STO和PMEF細(xì)胞可以分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF（fibroblastgrowthfactor）、分化抑制因子LIF(leukemiainhibitoryfactor)，這些因子有助于ES細(xì)胞增值，而且能抑制細(xì)胞的凋亡和分化。此外，也可以用綿羊、山羊的輸卵管或子宮上皮、牛的顆粒細(xì)胞、子宮成纖維細(xì)胞等作為分化抑制培養(yǎng)基[13]。3.2.2早期胚胎及PGCs的選擇和分離

以下早期胚胎都可以作為建立胚胎干細(xì)胞系的材料：小鼠的桑椹胚（2日齡），囊胚（3日齡）和延遲囊胚（4-6日齡）；豬的囊胚（7-10日齡）；綿羊的囊胚（7-9日齡）；山羊的囊胚（7-8日齡）；牛的桑椹胚（6-7日齡），囊胚（7-8）日齡；兔的囊胚（4-5日齡）；水貂的囊胚（8-10日齡）；倉(cāng)鼠的囊胚（3日齡）。3.2.3早期胚胎及PGCS的培養(yǎng)和ES細(xì)胞的分離傳代

將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、37~39℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEM+15%胎牛血清（FCS）。培養(yǎng)液中可添加多種細(xì)胞因子或分化抑制物，如分化抑制因子（LIF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、β—硫基乙醇（mercaptoethanol）等。

進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM增殖后或PGCS出現(xiàn)ES樣克隆后即可傳代。ES細(xì)胞的增殖速度很快，小鼠ES細(xì)胞每7-8小時(shí)倍增一次，豬類(lèi)ES細(xì)胞每20小時(shí)倍增一次，羊類(lèi)ES細(xì)胞，每40-50小時(shí)倍增一次，牛類(lèi)ES細(xì)胞每18-24小時(shí)倍增一次14。傳代時(shí)一般是用胰酶EDTA消化，在用微吸管或撥針將其打散成單個(gè)細(xì)胞，然后移入新的飼養(yǎng)層上，進(jìn)行培養(yǎng)幾天后，即可出現(xiàn)新的克隆點(diǎn)，在其分化之前可以再進(jìn)行傳代。3.2.4ES細(xì)胞的鑒定及保存

ES細(xì)胞的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定，堿性磷酸酶（AKP）染色，表面抗原檢測(cè)，核型分析，體外分化實(shí)驗(yàn)，嵌合體實(shí)驗(yàn)，核移植等。

ES細(xì)胞保存方法一般是冷凍保存，比早期胚胎的凍存技術(shù)要簡(jiǎn)單一些。冷凍保護(hù)液一般為DAEM+30%-50%NBCS（新建牛血清）+10%DMSO（二甲基亞砜）。冷凍過(guò)程為：室溫下平衡10分鐘→10℃冰箱3-5小時(shí)→-7℃冰箱過(guò)夜→第二天放入液氮中長(zhǎng)期保存，也可以-70℃冰箱保存幾個(gè)月。解凍一般在37℃水浴中進(jìn)行，解凍后立即用新的培養(yǎng)液替換冷凍保護(hù)液，隨后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4.ES細(xì)胞的應(yīng)用及前景ES細(xì)胞特有的生物學(xué)特性,決定了其在生物學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價(jià)值.在進(jìn)行ES細(xì)胞建系和定向分化的同時(shí),在核移植,嵌合體,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究等方面也進(jìn)行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細(xì)胞在加快良種家畜繁育,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,哺乳動(dòng)物發(fā)育模型,基因和細(xì)胞治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

4.1ES細(xì)胞與動(dòng)物克隆

ES細(xì)胞具有可以無(wú)限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點(diǎn)。如果以ES細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。而且用ES細(xì)胞與胚胎進(jìn)行嵌合克隆動(dòng)物,可以解決哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動(dòng)物,也可以進(jìn)行異種動(dòng)物克隆,有助于保護(hù)珍惜野生動(dòng)物.自綿羊“多莉”出世后，許多科學(xué)家對(duì)體細(xì)胞克隆進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，并取得了成功。但是，盡管體細(xì)胞克隆與ES細(xì)胞克隆相比有著易于取材的特點(diǎn)，但是體細(xì)胞克隆也存在著不少缺點(diǎn)，如生理和免疫缺陷，目前體細(xì)胞克隆還不能完全代替ES細(xì)胞克隆。4.2基因載體

目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表達(dá)和篩選工作是在個(gè)體水平上進(jìn)行的，不僅工作繁瑣，周期長(zhǎng)成功率低，產(chǎn)生的后代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離；而利用ES細(xì)胞作為基因載體，得到基因整合的細(xì)胞，將載體ES細(xì)胞直接進(jìn)行核移植或者通過(guò)與胚胎嵌合獲得嵌合動(dòng)物，ES細(xì)胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細(xì)胞，即可以得到攜有目的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。因?yàn)橐粋€(gè)優(yōu)良的ES細(xì)胞系不僅可以用于各種目的基因轉(zhuǎn)化，用各種方法將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞，而且外源基因的整合數(shù)目、位點(diǎn)、表達(dá)程序以及穩(wěn)定性等都可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行加工，篩選，在很大程度上加快了動(dòng)物遺傳工程的進(jìn)程。現(xiàn)在已經(jīng)有不少有關(guān)以ES細(xì)胞作為外源基因載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)道。Hooper用逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA隨機(jī)插入和同源重組法得到了次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）缺失的ES細(xì)胞系，并獲得了HPRT缺失的嵌合體小鼠，建立了豬TGF-B1cDNA的ES細(xì)胞。曾諱清將HGF基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，獲得了轉(zhuǎn)染HGF基因的ES細(xì)胞。

一、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

二、推廣人工授精與同期發(fā)情技術(shù)

（一）準(zhǔn)確發(fā)情鑒定與同期發(fā)情處理

（二）適時(shí)配種

（三）優(yōu)質(zhì)良種精液

（四）改善人工授精配種技術(shù)，嚴(yán)把無(wú)菌關(guān)

（五）提高情期受胎率

三、加強(qiáng)對(duì)圍產(chǎn)期疾病的防治

四、雙胎技術(shù)

五、不孕癥的治療

（一）卵巢機(jī)能減退

（二）持久黃體

（三）卵巢囊腫

（四）排卵障礙

一、概述

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是把某一特殊基因從動(dòng)物細(xì)胞中分離出來(lái)，或人為構(gòu)建外源目的基因，然后再將其轉(zhuǎn)移至另一動(dòng)物的生殖細(xì)胞或早期胚胎，使其穩(wěn)定地整合到動(dòng)物基因組中，并使該動(dòng)物獲得前者的遺傳性而且能遺傳給后代，從而改變動(dòng)物品種，獲取人類(lèi)所需的特殊物質(zhì)。利用該項(xiàng)技術(shù)獲得的動(dòng)物就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

1968，雞；

1974，鼠；

1982，超級(jí)小鼠；

1994，超級(jí)豬；

現(xiàn)已獲得了多種基因、多畜種、