固定化微生物簡介及海藻酸鈉包埋固定法分析研究 環(huán)境工程專業(yè)

固定化微生物簡介及海藻酸鈉包埋固定法分析研究環(huán)境工程專業(yè)摘要：固定化微生物技術(shù)起始于1959年，由Hattori等人首次實現(xiàn)了大腸桿菌的固定化，此后發(fā)展迅速。該技術(shù)最初主要用于工業(yè)發(fā)酵，20世紀(jì)70年代以后，由于水污染嚴(yán)重，迫切需要一種高效、快速，能連續(xù)處理的廢水處理技術(shù)，從而微生物固定化技術(shù)才在污水處理中得到廣泛應(yīng)用[1]。固定化微生物技術(shù)是將微生物固定在載體上使其高度密集并保持其生物活性功能，在適宜條件下還可以增殖以滿足應(yīng)用之需的生物技術(shù)。在生物反應(yīng)器中所使用的微生物菌體往往被稱之為生物催化劑。由于在傳統(tǒng)的廢水生物處理工藝中，微生物通常是在水中以懸浮態(tài)生長的，因而易于從反應(yīng)器中流失，又由于其與水的密度差小，因此從流出的水中回收微生物進(jìn)行重復(fù)利用將變得較為困難或復(fù)雜。為此，采用固定化技術(shù)，將微生物通過一定的技術(shù)手段是微生物固著生長，有利于提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物的數(shù)量，利于反應(yīng)后的固液分離，利于去除氮，取出高濃度有機(jī)物或難以生物降解物質(zhì)，提高系統(tǒng)的處理能力和適應(yīng)性，是一項高效低耗，運(yùn)行管理簡單的廢水生物處理技術(shù)[2]。關(guān)鍵詞：固定化，載體，海藻酸鈉，細(xì)胞活性，前景1.引言下面介紹一下固定化微生物中的一些基礎(chǔ)知識，即固定化微生物的要求，載體的要求，以及載體種類，制備等。1.1被固定的微生物（主要是人為選定的特效降解菌的優(yōu)勢菌種）基本條件：①投加的菌體活性高；②菌體可快速降解目標(biāo)污染物；③在系統(tǒng)中不僅能競爭生存，而且可維持相當(dāng)數(shù)量[1]。1.2固定化載體為微生物創(chuàng)造了更不易解體的生存環(huán)境，所以一個理想的固定化載體的選擇也很重要。適合于廢水處理的固定化載體應(yīng)具有以下性能：①對微生物無毒，生物滯留量高，不干擾生物分子的功能；②傳質(zhì)性能好；③具有足夠的機(jī)械、物理和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被生物降解；④機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長；⑤固定化操作簡單；⑥對其它生物的吸附??；⑦價格低廉[1]。1.3載體分類目前常用的載體可分為無機(jī)載體、有機(jī)高分子載體和復(fù)合載體3大類型。無機(jī)載體如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。有機(jī)載體還可分為兩類：一類是高分子凝膠載體，如瓊脂、角叉萊膠和海藻酸鈣等；另一類有機(jī)合成高分子凝膠載體，如聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠、光硬化樹脂、聚丙烯酸凝膠等。復(fù)合載體是由無機(jī)載體和有機(jī)載體材料結(jié)合而成，使兩類材料的性能互補(bǔ)，從而顯示復(fù)合載體材料的優(yōu)越性[1]。1.4固定化微生物的制備方法

物理固定法主要有包埋法、吸附法（載體結(jié)合法）和包絡(luò)法，化學(xué)固定法包括共價結(jié)合法和交聯(lián)法（架橋法）[1]，又有自溶酶滅活法，絮凝吸附法[4]等。目前，國內(nèi)外學(xué)者對可用做包埋載體的有機(jī)物的研究較為廣泛，相關(guān)報道很多，但主要有聚乙烯醇、海藻酸鈉、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇縮丁醛等幾類[1]。2.海藻酸鈉固定法2.1基本機(jī)理[5]海藻酸鹽是棕色藻類的胞內(nèi)產(chǎn)物，它由兩種不同類型的單糖組成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4——L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸鹽是一種聚合物。海藻酸系天然有機(jī)高分子電解質(zhì)，其一價鹽(Na+,K+,NH4+)為水溶性鹽而二價以上的鹽(Ca2+,Al3+)為水不溶性鹽，因此可形成耐熱的凝膠或被膜，這是海藻酸鈉經(jīng)CaC12溶液鈣化后形成固定化凝膠的內(nèi)在機(jī)理。同時，海藻酸鈉易與蛋白質(zhì)、明膠等多種物質(zhì)共溶，并可與細(xì)胞混合形成均勻的懸浮液，使凝膠具有微生物分布的均勻性。除此之外，海藻酸鈉還具有價格低廉、水溶液粘度很大(1%的溶液可達(dá)200cp)、不易被大多數(shù)微生物降解等良好特性。由于組成海藻酸鹽單體的結(jié)構(gòu)中含有羧基和羥基能與金屬離子發(fā)生螯合作用，因此海藻酸鹽在包埋微生物的同時更可增加其吸附容量。海藻酸鈉與微生物的混合液與鈣離子發(fā)生的凝膠反應(yīng)主要在羧基上進(jìn)行，用反應(yīng)式表示為:具體操作方法是:取一定量的濕菌體細(xì)胞，與濃度為3%的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴入4℃的濃度為4%的氯化鈣溶液，形成直徑2-3mm的均勻小球，鈣化4h，然后用去離子水洗滌。2.2生產(chǎn)方法[6]A.C.Hulstl等曾經(jīng)報道了一種可以大量制作海藻酸鈣的方法，其實驗裝置，如圖1所示:此裝置靠機(jī)械帶動震針上下震動，向上時產(chǎn)生負(fù)壓吸入細(xì)胞懸浮液，向下運(yùn)動則打出小球。根據(jù)海藻酸鈉-細(xì)胞懸浮液的密度、粘度、表面張力和所需小球的粒徑等條件，計算出震針的震動頻率和幅度。用此裝置一分鐘可產(chǎn)生400-500粒固定化顆粒，為這種固定化方法的工業(yè)化運(yùn)用開辟了道路。用這種方法生成的小球在與磷酸、檸檬酸、EDTA和乳酸等溶液接觸后，海藻酸鈣凝膠顆粒會逐步解體。用聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛對包埋小球進(jìn)行交聯(lián)強(qiáng)化可以有效地解決這一問題。先將固定化顆粒置于的PEI-CaC12混合溶液中，間歇攪拌24h，取出，用水洗滌，再置于戊二醛溶液中攪拌lmin，得強(qiáng)化固定化細(xì)胞顆粒。實驗表明最佳強(qiáng)化條件是:PEI濃度0.55%，戊二醛濃度1.0%,CaC12為50mmol/L,PEI-CaC12混合溶液pH=8.20。2.3固定化方法2.3.1實驗一[4]用海藻酸鈣包埋固定熱帶假絲酵母菌，在三相流床反應(yīng)器中連續(xù)處理含酚廢水，進(jìn)水酚濃度為300mg/L，出水酚濃度小于0.5mg/L，分的最大容積負(fù)荷比活性污泥法高1倍，其污泥發(fā)生量僅為活性污泥法的1/10。2.3.2實驗二以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下[5]：方法I=1\*GB3①將海藻酸鈉加熱溶于水；=2\*GB3②將海藻酸鈉溶液與微生物細(xì)胞混合均勻，使海藻酸鈉最終濃度為2%~4%；=3\*GB3③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%~10%的CaCl2溶液中，固定化7~8h；=4\*GB3④濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法II=1\*GB3①將按方法I制得的固定化細(xì)胞顆粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中攪拌1~2h；=2\*GB3②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；=3\*GB3③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法III=1\*GB3①將按方法I制備的固定化顆粒浸泡于下列溶液中：殼聚糖0.5%CaCl20.2mol/LpH6.0=2\*GB3②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；=3\*GB3③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。分別利用以上三種固定化方法，包埋黑曲酶細(xì)胞，比較各種固定化細(xì)胞的活性，其結(jié)果如表1：表1海藻酸鈣包埋法的比較固定化方法方法I方法II方法III固定化細(xì)胞相對活性57.1%52.9%44.8%由表1可以看出，用海藻酸鈉系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化細(xì)胞的活性較高。其中用方法I固定化細(xì)胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜，雖然增強(qiáng)了固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，但是同時加大了底物及氧的擴(kuò)散阻力，從而降低了細(xì)胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛對細(xì)胞液具有毒性，在使用前應(yīng)作毒性試驗，確定是否采用改種交聯(lián)劑。2.4海藻酸鈉包埋法固定化試劑對細(xì)胞活性的影響2.4.1海藻酸鈉對細(xì)胞活性的影響海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類，對微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度、質(zhì)量傳遞等，進(jìn)而影響到微生物的活性。海藻酸鈉濃度對固定化細(xì)胞活性的影響如表2所示。表2海藻酸鈉濃度對細(xì)胞活性的影響海藻酸鈉濃度細(xì)胞相對活性成球難易海藻酸鈉濃度細(xì)胞相對活性成球難易1.0%56.2%易2.5%52.3%易1.5%57.1%易3.0%45.6%較難2.0%55.4%易2.4.2CaCl2濃度細(xì)胞活性的影響在海藻酸鈉包埋固定化過程中，凝膠化劑CaCl2中的Ca2+于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細(xì)胞固定。CaCl2溶液的濃度對固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的影響見表3。表3CaCl2濃度對固定化細(xì)胞凝膠機(jī)械強(qiáng)度的影響CaCl2濃度/%234510機(jī)械強(qiáng)度較好較好較好好好隨著CaCl2濃度的增加，微生物細(xì)胞的活性降低。當(dāng)CaCl2濃度低于5%時，細(xì)胞活性可以保持在80%以上；但是當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到10%，細(xì)胞活性下降到60%左右，主要原因估計有兩種（=1\*romani）由于鹽的滲析作用，引起細(xì)胞脫水，致使微生物活性部分喪失；（ii）在PCR技術(shù)中，CaCl2是使細(xì)胞處于感受態(tài)的物質(zhì)，這個時候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干擾破壞。從表四可以看出，CaCl2濃度對固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度影響較大。當(dāng)CaCl2濃度為2%~3%時，固定化顆粒在使用過程中會出現(xiàn)膨脹，甚至出現(xiàn)裂縫或破碎現(xiàn)象。因此，海藻酸鈣包埋法固定化細(xì)胞活性較高。3固定化細(xì)胞性能的評價3.1固定化顆粒的密度固定化顆粒是指一定體積內(nèi)固定化顆粒的量，因此，確定固定化顆粒的密度，也就是測定其體積和重量[2]。3.2固定化顆粒的通透性和機(jī)械強(qiáng)度固定化顆粒的通透性，是用來衡量的固定化細(xì)胞與外界交換能力的重要指標(biāo)。通透性越好，固定化細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換越容易，固定化微生物對于外界污染物的降解能力越強(qiáng)。機(jī)械強(qiáng)度，主要衡量固定化顆粒在外界的持續(xù)壓力沖擊下保持形狀的能力，一般來說，機(jī)械強(qiáng)度越大，顆?？芍貜?fù)利用率越高，在工程上的應(yīng)用價值越大。但是在固定化過程中，固定化時間越長，顆粒的機(jī)械強(qiáng)度越大，通透性卻降低；反之，固定化時間越短，通透性提高，機(jī)械強(qiáng)度卻無法保證。因此，在實驗中應(yīng)該綜合考慮兩個因素，在兩個指標(biāo)中尋找最優(yōu)的組合[5]。3.3固定化顆粒的最適溫度、最適pH值由于在存在狀態(tài)上與游離的微生物不同，因此在最適溫度和最適pH值方面也會有很大的不同。通過做對照試驗，測出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率，從而找出最佳的降解的溫度和pH值?？梢钥吹?，在固定化以后，微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴(kuò)大[5]。3.4微生物的包埋量由于在制作固定化顆粒的過程中，不可避免的會有一部分微生物沒有包埋到顆粒之中，這部分微生物不會參加對污染物的降解，因而在一定程度上會影響降解的效果。因此包埋量的測定也是評價固定化好壞的一個很重要的指標(biāo)。4.總結(jié)4.1通過實驗一和實驗二可以看出海藻酸鈉包埋法操作簡單，而且發(fā)展出了適合大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)，海藻酸鈉可比較廣泛的應(yīng)用于固定化，這就使此方法有較大的應(yīng)用范圍。海藻酸鈉溫和無毒，固定化的細(xì)胞容易適應(yīng)，適合于固定活細(xì)胞或敏感細(xì)胞。用海藻酸鈉與氯化鈣交聯(lián)生成的海藻酸鈣固定包埋的微生物保持了較高的生物活性，但是在含有多價陰離子以及高濃度電解質(zhì)溶液中比較不穩(wěn)定，Ca2+容易脫落，包埋強(qiáng)度也隨著鈣離子的脫去而逐漸變?nèi)酰詈罂赡艹霈F(xiàn)破損的現(xiàn)象。當(dāng)存在高濃度的K+、Mg2+、磷酸鹽以及其他單價金屬離子時，海藻酸鈣凝膠的結(jié)構(gòu)也易受到破壞。除此之外，由于海藻酸鈣凝膠網(wǎng)格的孔隙太大，酶可能會從網(wǎng)格中滲露出來。這是將其廣泛應(yīng)用于大規(guī)模廢水處理所急需解決的問題，而在實際應(yīng)用中常常添加其它添加物以增加其強(qiáng)度。4.2從固定化微生物技術(shù)誕生之初到現(xiàn)在，固定化微生物技術(shù)有了長足的發(fā)展，特別是在處理廢水領(lǐng)域，相應(yīng)的理論構(gòu)造己發(fā)展成型、并積累了很多寶貴的經(jīng)驗。目前的現(xiàn)狀如下:(1)厭氧微生物利用較多(2)固定化方法中以膠體包埋法為多(3)厭氧處理常用固定床，好氧處理多用流化床(4)適于在高負(fù)荷條件下運(yùn)轉(zhuǎn)(5)剩余污泥產(chǎn)生量少(6)對水質(zhì)水量變化的適應(yīng)性能力強(qiáng)[7]同時固定化微生物技術(shù)存在的許多急需解決的問題也顯現(xiàn)出來:(1)廉價高效的固定微生物載體的開發(fā)(2)提高載體的重復(fù)使用率，延長使用壽命，降低使用成本(3)適合特定處理的微生物種群的選擇(4)開發(fā)新型高效的固定化微生物反應(yīng)器[1](5)混合固定化技術(shù)的進(jìn)一步研究和開發(fā)(6)開發(fā)成型的固定化微生物（細(xì)胞）傳感器[2]廣泛應(yīng)用在處理氨、氮廢水，固定化活性污泥除BOD物質(zhì)，難降解有機(jī)廢水（含酚廢水，含芳香烴廢水，處理LAS廢水，處理重金屬廢水）等。固定化微生物方法在污水處理中較物理法，化學(xué)法等有著明顯的優(yōu)勢，如克服了生物細(xì)胞太小，與水溶液分離困難，易造成二次污染缺點等缺點，而有著效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、能純化和保持高效穩(wěn)定濃度菌種等優(yōu)點。同時，也有著明顯的不足，如缺乏廉價優(yōu)良載體，在文中海藻酸鈉包埋法中有著很好的生物活性但卻也有包埋強(qiáng)度較差的劣勢，其他還有需嚴(yán)格控制微生物生長環(huán)境等。優(yōu)良菌種的選擇，高活性高強(qiáng)度載體的出現(xiàn)，新的包埋方法的研究都將促進(jìn)固定化微生物技術(shù)在污廢水處理中的應(yīng)用[8]。參考資料：[1]高紅梅,固定化微生物技術(shù)及其在養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用,中國飼料行業(yè)信息網(wǎng),/tech/biotech/200509/8208