DB13-T1420-2011馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20

B05

DB13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T1420—2011

馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術(shù)規(guī)程

Technologicalrulesfordetectingfungicideresistance

inPhytophthorainfestansonpotato

DB13/T1420—2011

馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測的術(shù)語和定義及檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯晚疫病菌對殺菌劑的抗性檢測。

2術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1

抗藥性fungicideresistance

一種殺菌劑當(dāng)用其標(biāo)簽推薦的劑量防治作物病害時(shí)，即使重復(fù)試驗(yàn)也無法達(dá)到所期望的防治效果，

該靶標(biāo)病菌群體的敏感性下降的遺傳變化稱為抗藥性。

2.2

敏感基線sensitivitybaseline：

在同類作用方式的殺菌劑使用之前，靶標(biāo)病菌群體中不同菌株對一種藥劑的敏感性(EC50值)分布曲

線，常用平均值及95%置信限表示。

2.3

敏感型sensitivitytype：

根據(jù)菌株對藥劑的敏感性(EC50值)或抗性水平，或在區(qū)分劑量下藥劑對菌株的抑制程度，將菌株劃

分成敏感、低抗、中抗、高抗等不同類型。

2.4

菌絲生長速率法

馬鈴薯晚疫病菌菌絲體在含藥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)而生長受到抑制的毒力測定方法，適用于檢測馬鈴

薯晚疫病菌對能顯著抑制其菌絲生長的苯基酰胺類、QoI類、羧酸酰胺類、乙酰胺類、氨基甲酸酯類、

苯甲酰胺類等殺菌劑的抗藥性。

2.5

葉盤漂浮法

馬鈴薯晚疫病菌孢子囊接觸漂浮于藥液上的葉盤背面而萌發(fā)受到抑制的毒力測定方法，適用于馬

鈴薯晚疫病菌對具有內(nèi)吸性的苯基酰胺類、QoI類、羧酸酰胺類、乙酰胺類、氨基甲酸酯類、苯甲酰胺

類等殺菌劑的抗藥性檢測。

3測定方法

3.1菌絲生長速率法

適用于檢測馬鈴薯晚疫病菌對能明顯抑制其菌絲生長的甲霜靈、精甲霜靈、噁霜靈、嘧菌酯、吡唑

醚菌酯、烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺、代森錳鋅、

百菌清及其混劑的抗性。

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DB13/T1420—2011

3.1.1供試菌株的采集、分離及保存

田間采集感染晚疫病的馬鈴薯新鮮葉片，夾入洗凈蘸干的馬鈴薯塊莖中，做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室，

16~18℃培養(yǎng)2～3d。在無菌條件下，將塊莖上霉?fàn)钗镉媒臃N針挑至含100μg/mL氨芐青霉素、20μg/mL

利福平及100μg/mL五氯硝基苯的黑麥瓊脂培養(yǎng)基(Ryeagar,RA)平板上，18~20℃培養(yǎng)4~5d，將未受

雜菌污染的菌絲轉(zhuǎn)接到新的RA平板上，18~20℃培養(yǎng)7～10d后轉(zhuǎn)至試管中RA斜面上，培養(yǎng)至菌絲長

滿，在10℃條件下保存，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。

3.1.2供試藥劑的收集及保存

收集殺菌劑原藥，保存于避光、低溫（0-4℃）及干燥條件下。

3.1.3含藥培養(yǎng)基的制作

稱取適量的原藥，用有機(jī)溶劑（如丙酮、二甲亞砜等）溶解，以無菌水稀釋成母液（丙酮含量應(yīng)低

于總體積的1%），再加入無菌水稀釋成系列濃度的藥液，按照藥液與培養(yǎng)基體積比1:9分別加入溶化

的RA中，混勻，潑碟，配制成含不同濃度藥劑的RA平板。對照僅加入適量DMSO或丙酮等溶劑。

3.1.4接種及培養(yǎng)

將菌株在RA平板上培養(yǎng)10d，從菌落邊緣以直徑0.5cm打孔器打菌餅，用接種針挑取菌餅接在

含藥RA平板（直徑9cm)中央，以不含藥RA平板為對照，每皿接1個(gè)菌餅，每處理重復(fù)3次。蓋上

皿蓋，18-20℃培養(yǎng)10d。

3.1.5結(jié)果檢查

待對照菌落長至直徑約7cm后，用直尺十字交叉測量菌落直徑(cm)2次，計(jì)算平均值。

3.1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

按下式計(jì)算各處理（不同濃度的藥劑）對菌絲生長的抑制率，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

D0?D1

P=×100…………………(1)

D0?0.5

式中：P為抑制率（％）；D0為對照菌落直徑（cm）；D1為處理菌落直徑（cm）。

采用SAS、DPS等統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行藥劑濃度對數(shù)值（X）與抑制率的幾率值（Y）之間的線性回歸分析，求出每種藥

劑對每個(gè)菌株的毒力回歸方程式（Y=a+bX）、相關(guān)系數(shù)和置信限。由毒力回歸方程式求出菌株對藥劑的敏感性(EC50值)。

3.1.7敏感基線(EC50)的建立

從未使用過某種藥劑及其相同作用機(jī)理藥劑的地區(qū)采集分離約100株馬鈴薯晚疫病菌，測其對該藥

的敏感性(EC50值)。將供試菌株對某種藥劑的敏感性(EC50值)劃分成不同區(qū)段（一般5個(gè)區(qū)段），確定

敏感性分布范圍（例如從較小的a到較大的b)，寫出濃度區(qū)段（等差數(shù)列）a,a+（b-a）/n,a+2（b-a）/n,

a+3（b-a）/n,a+4（b-a）/n,……,a+(k-1)×（b-a）/n（n為區(qū)段數(shù)，k為數(shù)列的序數(shù)），以每個(gè)區(qū)段菌株

出現(xiàn)頻率（%）為縱軸，以藥劑濃度區(qū)段為橫軸，畫出敏感性分布光滑曲線圖，由n個(gè)點(diǎn)連成，每一點(diǎn)

以(x,y)來表示，x=濃度區(qū)段中值，y代表該區(qū)段菌株出現(xiàn)頻率。利用DPS、SPSS等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行敏感

性數(shù)據(jù)正態(tài)性分布檢驗(yàn)，如果Ρ值>0.05，即在95%置信限內(nèi)，敏感性呈近似正態(tài)分布，則菌株可視為

野生敏感菌株，其敏感性(EC50值)平均值可作為敏感基線(EC50值)，計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字?；€

數(shù)據(jù)參照附錄A。

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DB13/T1420—2011

3.1.8抗性水平評估

敏感性（EC50值）

抗性水平＝×100．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．（２）

敏感基線（EC50值）

計(jì)算結(jié)果保留整數(shù)。

3.1.9菌株敏感型劃分

菌株對甲霜靈（或精甲霜靈）敏感型：高抗菌株：在含5μg/mL、100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）

的RA平板上菌落直徑≥對照菌落直徑的40﹪；中抗菌株：在含5μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA

平板上菌落直徑＞40%對照菌落直徑，在含100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落直徑＜

對照菌落直徑的40%；敏感菌株：在含5μg/mL、100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落

直徑均＜對照菌落直徑的40﹪。

菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁霜靈等高度固有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型：敏感菌株（S），敏感性

（EC50值）≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)；低抗

菌株（LR），(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<抗性水平≤100倍；中抗菌株（MR），100倍<抗

性水平≤500倍；高抗菌株（HR），抗性水平>500倍。

菌株對霜脲氰、烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺、霜霉威、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低度固

有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50值）≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水

平≤(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)；低抗菌株（LR），(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<

抗性水平≤10倍；中抗菌株（MR），10倍<抗性水平≤100倍；高抗菌株（HR），抗性水平>100倍。

3.1.10抗性頻率評估

抗性菌株數(shù)

抗性頻率（%）=×100……（3）

供試菌株數(shù)

計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。

3.1.11檢測報(bào)告的編寫

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果、抗性水平及抗性頻率評估，寫出正式抗性檢測報(bào)告，并列出原始數(shù)據(jù)。

3.2葉盤漂浮法

適用于檢測馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈、精甲霜靈、噁霜靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、氟嗎

啉、雙炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等內(nèi)吸殺菌劑及其混劑的抗性。

3.2.1供試菌株的采集、分離及保存

同3.1.1

3.2.2孢子囊懸浮液的配制

將保存在試管中RA斜面上的菌株轉(zhuǎn)接至薯片上培養(yǎng)，將霉?fàn)钗镉眠m量無菌水沖洗，或?qū)⑦m量無菌

水加入培養(yǎng)菌株10～15d的RA平板上，用刮板刮取菌落中的孢子囊，用2層紗布過濾，離心，以無

菌水稀釋，制備5×104孢子囊/mL的孢子囊懸浮液，4℃保存2.5h，備用。

3.2.3供試藥劑的收集、保存及配制

收集甲霜靈、精甲霜靈、噁霜靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺、霜脲氰、

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DB13/T1420—2011

霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等殺菌劑原藥。保存在避光、低溫（0-4℃）干燥條件下。實(shí)驗(yàn)時(shí)，

稱取適量的原藥，加入少量丙酮或二甲亞砜（DMSO）等有機(jī)溶劑溶解，再加入無菌水稀釋成母液，將

母液以無菌水稀釋成系列濃度的藥液。

3.2.4供試植株

在花盆中或日光溫室土壤中種植馬鈴薯感病品種（費(fèi)烏瑞它、夏坡蒂等），待長至7-8片復(fù)葉時(shí)，

取葉片用打孔器打成直徑1.5cm葉盤待用。

3.2.5接種及培養(yǎng)

每個(gè)直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入20mL藥液（對照加蒸餾水），每濃度1皿，將15片葉盤背面向上

漂浮在液面上。用微量移液器在每葉盤背面點(diǎn)接1滴10μL的孢子囊懸浮液。在每天光照16h18～20℃

的條件下培養(yǎng)4～5d。

3.2.6調(diào)查發(fā)病

待對照充分發(fā)病后調(diào)查每片葉盤產(chǎn)孢情況。根據(jù)產(chǎn)孢面積占葉盤面積的百分率劃分病級：

0級，無??；1級，1%～5%；3級，6%～10%；5級，11%～20%；7級，21%～50%；9級，＞50%。

3.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

按下式計(jì)算各處理病情指數(shù)和相對防效，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

∑(病葉盤數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)）

病情指數(shù)＝×100………….(4)

總?cè)~盤數(shù)×最大病級數(shù)

對照病情指數(shù)?處理病情指數(shù)

相對防效（%）＝×100……..(5)

對照病情指數(shù)

按照3.1.6所述方法統(tǒng)計(jì)出菌株對藥劑的敏感性(EC50值)。

3.2.8敏感基線(EC50值)的建立

同3.1.7

3.2.9抗性水平評估

同3.1.8

3.2.10菌株敏感型劃分

對甲霜靈或精甲霜靈敏感型：高抗菌株，EC50值＞10μg/mL；中抗菌株，EC50值為0.01～10μg/mL；

敏感菌株，EC50值＜0.01μg/mL。

對嘧菌酯、噁霜靈、吡唑醚菌酯等高度固有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型劃分同3.1.9。

對霜脲氰、烯酰嗎啉、氟嗎啉等低中度固有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型劃分同3.1.9。

3.2.11抗性頻率評估

同3.1.10

3.2.12檢測報(bào)告的編寫

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果、抗性水平及抗性頻率評估，寫出正式抗性檢測報(bào)告，并列出原始數(shù)據(jù)。

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DB13/T1420—2011

附錄A

（資料性附錄）

馬鈴薯晚疫病菌敏感基線

表A.1馬鈴薯晚疫病菌對不同殺菌劑的敏感基線（EC50值）數(shù)據(jù)

EC50值（μg/mL）

藥劑

菌落生長速率法葉盤漂浮法

甲霜靈metalaxyl0.0052±0.00240.0660±0.0183

精甲霜靈mefenoxam0.0027±0.00120.0325±0.0121

噁霜靈oxadixyl0.0076±0.00300.3105±0.1070

烯酰嗎啉dimethomorph0.0634±0.02250.2033±0.0965

氟嗎啉flumorph0.0569±0.02290.3530±0.1320

雙炔酰菌胺mandipropamid0.2006±0.06170.3106±0.1337

霜脲氰cymoxanil0.3375±0.11190.4108±0.2010

嘧菌酯azoxystrobin——0.2161±0.0893

吡唑醚菌酯pyraclostrobin——0.3066±0.1011

唑胺菌酯pyrametostrobin——0.4531±0.2332

氟吡菌胺fluopicolide0.1154±0.03440.4670±0.2005

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