實驗2分離以尿素為氮源的微生物

選擇培養(yǎng)基定義：是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學抗性而設計的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。實例應用：1、培養(yǎng)基中加入抗生素可以篩選出抗生素抗性菌2、培養(yǎng)基中缺乏碳源時，可篩選出自養(yǎng)型生物實驗2分離以尿素為氮源的微生物

一、實驗目的：1.使用專一的培養(yǎng)基（含尿素）分離專一的細菌（有脲酶的細菌）2.使用指示劑顏色的變化檢知酶（脲酶）所催化的反應。二、實驗原理：

脲即尿素，是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。有一些細菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作為其生長的氮源(反應式)(NH2)2C=O+H2O2NH3+CO2脲酶本實驗利用尿素培養(yǎng)基分離出土壤中能利用尿素的細菌，由于尿素在脲酶的催化下分解產(chǎn)生了NH3，溶液會呈堿性，可用酸堿指示劑顏色的變化檢測(1)全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.25g、酵母提取物0.12g、NaCl0.25g、瓊脂0.5g、加水25ml。(2)尿素固體培養(yǎng)基：0.025g葡萄糖、NaCl0.12g、K2HPO40.12g、

酚紅0.25mg、瓊脂糖0.5g、加水15ml。滅菌冷卻到60℃時加入經(jīng)G6玻璃漏斗過濾

（使其無菌）的尿素。

酸堿指示劑：酸黃堿紅三、設備及用品：P25四、實驗材料：（10倍稀釋法：0.5mL懸液

+4.5mL無菌水，搖勻即可）2.制備細菌懸液：1g土樣+99mL無菌水10-2土壤稀釋液并依次制備出10-3～10-5稀釋液。振蕩10min3、涂布分離法分離細菌：取10-4和10-5稀釋液各0.1ml，分別加到尿素培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀將菌液涂布分離4、倒置培養(yǎng)5、觀察：比較LB培養(yǎng)基與尿素培養(yǎng)基上的菌落五、實驗步驟1.制平板：LB固體培養(yǎng)基與尿素固體培養(yǎng)基對照組：LB固體培養(yǎng)基實驗組：尿素固體培養(yǎng)基各濃度做3個培養(yǎng)皿1克土樣990.50.50.50.5各盛有4.5ml無菌水-5-5-5-6-6-6分析與討論：1、為什么要用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基？2、有脲酶的細菌在生態(tài)穩(wěn)態(tài)上起什么作用？瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，如果用瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細菌，不利于以尿素為氮源的細菌的篩選脲酶的細菌能將尿素轉(zhuǎn)化為氨，供植物利用。因此脲酶的細菌對生態(tài)系統(tǒng)中N元素的循環(huán)有重要作用3、有脲酶的細菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)？4、與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？細菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中的尿素水解，尿素分解后產(chǎn)生氨，氨為堿性，酚紅在酸性環(huán)境中為黃色，在堿性環(huán)境里變?yōu)榧t色。培養(yǎng)基中的酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化，標志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株可以以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強能利用尿素的細菌在土壤菌群中只占極少數(shù)量。因為人和其他哺乳動物產(chǎn)生的排泄物畢竟是少量的，而且尿素還可以在高溫下自然分解，因此，以尿素為氮源的菌群較少1、土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌（目的菌）。培養(yǎng)基成分如表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g瓊脂15g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到100mL

（1）培養(yǎng)基中加入尿素的目的是篩選

，這種培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。（2）“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的

和

，實驗需要振蕩培養(yǎng)，原因是

目的菌選擇尿素

為目的菌提供氧氣

葡萄糖

（3）圖中將細菌轉(zhuǎn)到固體培養(yǎng)基上時，常采用

的方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。（4）在進行分離分解尿素的細菌實驗時，A同學從培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落。A同學的實驗結(jié)果產(chǎn)生的原因可能有

（填序號）。①土樣不同

②培養(yǎng)基污染

③操作失誤

④沒有設置對照（5）實驗結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基應該進行

處理后，才能倒掉。涂布平板（劃線）①②③滅菌

1.為了實現(xiàn)燃料供應來源多樣化，發(fā)展長期替代化石燃料的產(chǎn)品如燃料酒精、生物柴油、沼氣等已經(jīng)列入我國未來10年的發(fā)展計劃。廣東省是我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)之一。甘蔗是一種高光效的植物，單位面積產(chǎn)量很高，種植面積日益擴大，目前已成為南方

地區(qū)燃料酒精生產(chǎn)的重要原料。利用甘蔗生產(chǎn)燃料酒精的一般工藝流程為：甘蔗榨汁（蔗糖）、酵母發(fā)酵﹑蒸餾﹑成品（燃料酒精）。請根據(jù)上述材料，回答下列問題：

(1)簡述甘蔗大規(guī)?？焖俜敝臣夹g的過程

選取甘蔗外植體，通過誘導脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后通過調(diào)整植物激素比例，再分化形成芽和根，獲得大量試管苗（或通過誘導大量形成胚狀體，制成人工種子，適宜條件下萌發(fā)長成幼苗）。（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精發(fā)酵菌種，對野生酵母菌進行誘變后通過篩選可以得到具有這些特性的突變菌，誘變及篩選過程如下：步驟1：野生菌液體培養(yǎng)一段時間后接受紫外線照射誘變處理。步驟2:制備選擇培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎上，注意

和，加瓊脂后滅菌，制成固體平板。

步驟3：將紫外照射后的菌液稀釋涂布平板。

步驟4：根據(jù)

篩選出突變菌。

（3)上述步驟2、3和4的依據(jù)分別是＿。

添加高濃度蔗糖（葡萄糖）調(diào)低pH值

是否能在選擇培養(yǎng)基上生長提供高糖和酸性的篩選環(huán)境；獲得單菌落；能生長代表該菌落具有耐高糖和耐酸的特性。(4）利用獲得的突變菌和蔗汁進行酒精發(fā)酵實驗，除了將培養(yǎng)基

滅菌、保持空間潔凈外，發(fā)酵過程中防止外來雜菌入侵還有

哪些可行方法？（列舉兩種）

（5)甘蔗榨汁以后還有大量的蔗渣廢棄物，主要成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素,但是酵母菌無法直接利用，原因是其＿。請?zhí)岢鼋鉀Q該問題的方法。（列舉兩種方法）

①利用突變菌的耐酸特性，降低培養(yǎng)基的pH值，達到抑菌的目的；②利用突變菌的耐高糖特性，通過高滲環(huán)境達到抑菌目的；③保持厭氧環(huán)境，達到抑菌目的；④在培養(yǎng)基中添加一些抑制物如特殊的抗生素，達到抑菌目的。缺乏相應分解酶系（或缺乏纖維素酶和半纖維素酶）。在酵母菌中轉(zhuǎn)入分解酶系相關基因；利用酶或微生物分解蔗渣；利用物理和化學方法分解蔗渣；將酵母菌與其他能分解蔗渣的微生物混合發(fā)酵。

2.自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進行數(shù)量測定的實驗，請回答有關問題。

步驟如下：A.制備稀釋倍數(shù)為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的系列稀釋液。B.為了得到更加準確的結(jié)果，你選用

接種樣品。C.適宜溫度下培養(yǎng)。結(jié)果分析：(1)測定的大腸桿菌數(shù)，在對應稀釋倍數(shù)為10-6的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確可信的是()A.一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是23B.兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是22和26，取平均值24C.三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、5和52，取平均值26D.四個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、30、24和25，取平均值25稀釋涂布平板法D

(2)一同學在稀釋倍數(shù)為10-5的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為23.4，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.2ML)_______________。(3)用這種方法測定