KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用課件

KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用1精選2021版課件匯報(bào)內(nèi)容KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開發(fā)簡(jiǎn)介2精選2021版課件KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義3精選2021版課件KRAS背景KRAS是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。4精選2021版課件KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed5精選2021版課件結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤K-ras基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。6精選2021版課件KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol7精選2021版課件非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。8精選2021版課件KRAS主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于codon12(80%)、codon13(15-20%)、codon61和146(<5%)；在肺癌中，約97%的KRAS突變發(fā)生于codon12、13，其余位于codon61和146。突變密碼子堿基變化CosmicIDGly12Asp12GGT＞GAT521Gly12Val12GGT＞GTT520Gly12Ser12GGT＞AGT517Gly12Cys12GGT＞TGT516Gly12Ala12GGT＞GCT522Gly12Arg12GGT＞CGT518Gly13Asp13GGC＞GAC5329精選2021版課件EGFR突變背景EGFR基因位于染色體7p11.2，大小約200kb，是上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10%左右，而在東亞為30-50%。其中在亞洲、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR突變率最高，達(dá)70-80%。10精選2021版課件EGFR突變背景研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼、厄洛替尼的療效密切有關(guān)。其中EGFR突變的患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼治療敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。吉非替尼、厄洛替尼作為一線藥物治療非小細(xì)胞肺癌，相比傳統(tǒng)的化療可以取得更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS），且副作用相對(duì)較小，患者容易耐受，但總體生存期（OS）并未延長(zhǎng)。EGFR-TKI目前主要用于非小細(xì)胞肺癌一線、二線和維持治療。我國(guó)大部分醫(yī)生將其用于二線（69.4%）治療，41.7%的醫(yī)生將其用于一線治療，27.8%的醫(yī)生將其作為維持治療藥物。11精選2021版課件EGFR突變影響肺癌藥物療效研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMed12精選2021版課件EGFR突變檢測(cè)相關(guān)指南美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011版的癌癥治療指南中明確指出：EGFR突變，尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變，與腫瘤對(duì)TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系。而部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥，與EGFR外顯子20突變密切相關(guān)。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）在JCO上發(fā)表報(bào)告：EGFR-TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物，有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。歐洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）僅對(duì)攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效，平均無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)3.5月。美國(guó)FDA（2013）批準(zhǔn)對(duì)擬采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的試劑盒（therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas?EGFRMutationTest）；我國(guó)《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》中也明確指出EGFR突變，尤其是19號(hào)外顯子缺失突變與腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的敏感度有重要關(guān)系；對(duì)腺癌、大細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類型，EGFR檢測(cè)為一類推薦。13精選2021版課件EGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測(cè)29個(gè)）突變外顯子堿基變化CosmicIDG719A182156G>C6239G719S182155G>A6252G719C182155G>T6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753>S192240-2257del1812370E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750>A192237-2251del1512678E746-S752>A192237-2254del1812367E746-S752>V192237-2250>T(complex)12384E746-S752>D192238-2255del186220L747-A750>P192238-2248>GC(complex)12422L747-T751>Q192238-2252>GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG>C12382L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387L747-T751>S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751>P192239-2251>C(complex)12383T790M202369C>T6240S768I202303G>T6241V769-D770insASV202307-2308insGCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320insCAC12377D770-N771insG202310-2311insGGT12378L858R212573T>G6224L861Q212582T>A621314精選2021版課件EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系所在外顯子突變類型與EGFR-TKI療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點(diǎn)突變S768I藥敏突變20點(diǎn)突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點(diǎn)突變L858R藥敏突變21點(diǎn)突變L861Q藥敏突變15精選2021版課件ADxEGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)組別突變類型所占比例對(duì)吉非替尼敏感性證據(jù)

1Exon19deletions;L858R90%充分2T790M/deletion;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I7%有限3T790Malone;Exon20insertions;othermutations3%無(wú)16精選2021版課件ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)17精選2021版課件ARMS-PCR原理ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem(擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫。根據(jù)PCR過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè),當(dāng)引物3′末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí),產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其3′末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。18精選2021版課件ARMS-PCR原理TwoAllele-Specific(AS)primers,oneforeachalleleofaSNParedesigned.TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3'end.Twosetsofprimers,eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned.IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction,thereactioniscalledallele-specificPCR(AS-PCR).YouF.M.2008,BMCBioinformatics19精選2021版課件PCR產(chǎn)物檢測(cè)--RealtimePCR每個(gè)PCR循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)，不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)相比凝膠電泳：更快，可定量，無(wú)PCR產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpion(Qiagen)，雙環(huán)探針(廈門艾德)，Taqman，Molecularbeacons，Sybrgreen，Yo-proFigure2ThesensitivityofQuanTAS-PCRforquantifyingJAK2mutantalleles.ZapparoliG.V.2013,BMCCancer20精選2021版課件應(yīng)用于Realtime-PCR的ARMS-PCRGCATGAAGGalleleAallele5’5’5’5’3’3’3’3’ASprimerASprimerMismatchMismatchReverseprimerReverseprimerFAM-5’3’-BHQ1FAM-5’3’-BHQ1ProbeProbe21精選2021版課件ARMS技術(shù)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（0.1-1%）操作簡(jiǎn)便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型缺點(diǎn)：方法建立需時(shí)較長(zhǎng)僅能檢測(cè)已知突變22精選2021版課件測(cè)序法與ARMS法相比較Sanger測(cè)序法焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率低較高高商用試劑盒無(wú)有有流程與速度1-2天2-3天<1天數(shù)據(jù)分析要求高高低試劑成本低低略高儀器成本高高低23精選2021版課件操作流程及數(shù)據(jù)解讀24精選2021版課件檢測(cè)流程與質(zhì)量控制標(biāo)本準(zhǔn)備DNA抽提突變檢測(cè)分析報(bào)告標(biāo)本種類標(biāo)本量SOPOD260/280（新鮮組織）qPCR （FFPE）SOP陽(yáng)性及陰性對(duì)照問(wèn)題及解決SOP報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)判讀形式及檢查25精選2021版課件使用ARMS的KRAS突變檢測(cè)試劑盒試劑盒公司密碼子位點(diǎn)個(gè)數(shù)檢測(cè)技術(shù)TheraScreenassayQiagencodon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和蝎形探針技術(shù)KRAS檢測(cè)試劑盒廈門艾德codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和雙環(huán)探針技術(shù)人K-RAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒上海透景(Tellgen)codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和Taqman探針技術(shù)人類KRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒武漢友芝友Codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR熒光探針?lè)ㄈ薑RAS基因突變檢測(cè)試劑盒蘇州工業(yè)園codon12、134個(gè)突變ARMS-PCR和Taqman探針技術(shù)26精選2021版課件使用ARMS的EGFR突變檢測(cè)試劑盒DxSARMSADxARMS友芝友生產(chǎn)廠商英國(guó)DxS公司(Qiagen)廈門艾德公司武漢友芝友引物與探針設(shè)計(jì)蝎形引物與探針雙環(huán)引物與探針特異性引物和探針檢測(cè)突變種類29種29種29種突變判讀FAM信號(hào),ΔCt值FAM信號(hào),Ct值FAM信號(hào),Ct值DNA用量20ng10ng20ng樣本中檢測(cè)1%突變適用qPCR機(jī)型StratageneMx系列,ABI系列StratageneMx系列,ABI系列,Lightcycler480StratageneMx3000P,ABI7500,Lightcycler480等

27精選2021版課件等位特異性引物設(shè)計(jì)28精選2021版課件KRAS基因序列和常見(jiàn)突變KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG常見(jiàn)突變：Codon12Codon13Gly12SerGGT>AGTGly13SerGGC>AGCGly12ArgGGT>CGTGly13ArgGGC>CGCGly12CysGGT>TGTGly13CysGGC>TGCGly12AspGGT>GATGly13AspGGC>GACGly12AlaGGT>GCTGly13AlaGGC>GCCGly12ValGGT>GTTGly13ValGGC>GTC29精選2021版課件三引物設(shè)計(jì)原理YouF.M.2008,BMCBioinformatics30精選2021版課件三引物設(shè)計(jì) ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’ 19nt，51℃突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 19nt，49℃下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’ 25nt，54℃31精選2021版課件三引物設(shè)計(jì)—下游引物設(shè)計(jì) ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列： 5’-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3’互補(bǔ)鏈： 3’-CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5’下游引物： 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’32精選2021版課件3’端增加錯(cuò)配如果3’端是弱錯(cuò)配（C/A或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或C/T）才可阻斷3’端的擴(kuò)增；如果3’端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3’端的擴(kuò)增；當(dāng)3’端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3’下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’33精選2021版課件四引物設(shè)計(jì)34精選2021版課件四引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’內(nèi)引物（R）5’-ACTCTTGCCTACGCCACC-3’外引物（F）5’-ATGACTGAATATAAACT-3’外引物（R）5’-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3’35精選2021版課件KRAS試劑盒開發(fā)簡(jiǎn)介36精選2021版課件KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì)KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1.5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA-3’ 12GGT—GAT2.5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCG

GT-3’ 12GGT—GTT3.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ 12GGT—GCT4.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 12GGT—AGT5.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCG

T-3’ 12GGT—TGT6.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCC

C-3’ 12GGT—CGT7.5’-GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA-3’ 13GGC—GAC8.參照引物：5’-CTGAATA