時間分辨培訓

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)

培訓上海新波生物技術(shù)有限公司問題時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。TRF的標記物及特點。為什么叫“時間分辨”?TRF在免疫分析方法學中的地位。標記免疫學發(fā)展歷程放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）化學發(fā)光 （精度：10-15mol/L）電化學發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）

待測物質(zhì)濃度與檢測手段

臨床化學分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugs(藥物濃度)ThyroidHormone(甲狀腺激素)FertilityHormone(孕激素)CancerMarkers(腫瘤標記物)InfectiousDisease(傳染病)Vitamins(維生素)SerumProteins(血清蛋白)10-1210-910-610-310-0各種免疫方法學的比較放射性免疫分析法（RIA）應用放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻，是一項較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競爭法的標記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導致其試劑有效期短。標記物125I的穩(wěn)定性差，導致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造成浪費。操作繁瑣，出報告時間長。無法保存?zhèn)溆?。酶免疫分析法（ELISA）應用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強化學發(fā)光酶免疫技術(shù)曾經(jīng)一度被認為是取代放免的檢測手段。缺點靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應過程容易受環(huán)境因素影響，導致穩(wěn)定性不好?；瘜W發(fā)光免疫分析法（CLIA）應用單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。儀器種類：拜耳—ACS180系列雅培—AXSYM貝克曼—ACCESS德普—IMMULITE缺點樣品不能重復檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報廢。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。標準曲線穩(wěn)定性較差，需多次定標。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高。電化學發(fā)光免疫分析（ECL）應用80年代末期問世的新型化學發(fā)光免疫分析方法?；驹恚焊鶕?jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學發(fā)光反應。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價格過高。時間分辨熒光免疫（TRFIA）

（Time-ResoledFluoroimmunoassay）時間分辨熒光免疫的基本原理用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學發(fā)光物質(zhì)，標記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)；當免疫過程結(jié)束后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的物理特點（Ⅰ特異性強、ⅡStokes位移大、Ⅲ壽命長），并采用解離-增強技術(shù)（ⅣDELFIA）放大有效熒光；最后用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應最后產(chǎn)物的熒光強度。根據(jù)已知濃度所確定的標準曲線，來判斷未知樣品的濃度值，以達到定量分析的目的。乙肝表面抗原免疫反應圖

（時間分辨熒光法）乙肝表面抗體免疫反應圖

（時間分辨熒光法）乙肝ｅ抗原免疫反應圖

（時間分辨熒光法）乙肝ｅ抗體免疫反應圖

（時間分辨熒光法）乙肝核心抗體免疫反應圖

（時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）光路圖簡介氙燈紫外濾光透鏡分束器樣品杯濾光片PMT負反饋標記物為具有獨特熒光特性的稀土金屬---鑭系元素鑭系元素共有15種，應用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te)鑭系元素熒光特點：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團：1~100ns樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10ns，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm）銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移為28nm熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使本底達到0利用鑭系元素熒光物理特性，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光。而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。DELFIA技術(shù)為臨床檢測帶來的先進性技術(shù)特點檢驗先進性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離０背景、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復性更好原子標記

標記位點多，可達20個對標記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標準曲線保留時間長同一批次只需兩點定標多標記單，雙，三，四標記同一試劑盒可同時測多個項目不同標記物的波長0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標DELFIAhFSH標準曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期長N=6時間分辨熒光免疫的試劑種類甲狀腺功能檢測TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG性激素類檢測FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤標記檢測AFP，CEA，CA-153，CA-125，CA-199遺傳科檢查產(chǎn)前篩查：hAFP/

HCG，PAPPA新生兒篩查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU傳染病檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBcAb-IgM、HCV、HIV、TP血液科檢測貧血檢查：Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid科研工具單標記檢測，雙標記檢測，三標記檢測，四標記檢測時間分辨熒光免疫---突出優(yōu)點零本底、靈敏度高線性范圍寬試劑有效期長標準曲線穩(wěn)定性好易于自動化TRFIA作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學技術(shù)，將會給標記免疫學帶來一場革命。公司簡介上海新波生物技術(shù)有限公司是一家新近成立于上海浦東張江高科技開發(fā)區(qū)的高新技術(shù)企業(yè)，是國際上少數(shù)幾家掌握“時間分辨熒光免疫”檢測技術(shù)的廠家之一。新波生物致力于這一新技術(shù)的研究，現(xiàn)已在方法學研究、試劑合成、標記物的制備、抗原抗體純化、檢測儀器的生產(chǎn)等方面均取得了很大成果。2000年在國內(nèi)首家推出了ANYTEST2000型時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)，并列為上海市高新技術(shù)項目；與此儀器配套的試劑種類多達82種，其中58項用于臨床檢驗、24項用于科研。半自動ANYTEST2000Anytest2000時間分辨檢測儀ANYTEST2000主要特點試劑的多樣性種類多達82種，其中臨床58項、科研24項每年推出新診斷試劑盒（根據(jù)客戶不同需求而開發(fā)）

儀器的先進性

高靈敏度：10-18mol/L（Eu3+）線性范圍寬：10-13mol/L～10-18mol/L高穩(wěn)定性：＜±1%快速測試：1秒／樣標本量靈活：適合每天1～400份標本量適用范圍：各類大小型的醫(yī)院、生化實驗室應用于臨床檢測和科學試驗標準曲線、測試數(shù)據(jù)長期保存、共享智能化操作軟件

價格的可比性

進口試劑國內(nèi)分裝——價格與進口酶標試劑可比性專為中國設計的儀器——價格與進口γ計數(shù)儀的可比性ANYTEST2000智能化操作界面友好的主界面簡潔的操作過程強大的數(shù)據(jù)處理時間分辨法檢測“乙肝五項”的意義原子標記、靈敏度高，有效區(qū)分弱陽性與陰性血樣。二步法的采用，最大限度避免HOOK現(xiàn)象出現(xiàn)。（強陽性血樣檢測為陰性）定量檢測可以動態(tài)觀察治療效果。量化評估乙肝疫苗接種效果。結(jié)果準確、價格