11DNA重組技術(shù)的基本工具(正式)

基因工程專題1每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌消費(fèi)胰島素，大大降低了消費(fèi)本錢。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬。胰島素思索：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用基因工程的產(chǎn)物什么叫基因工程？基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)展嚴(yán)厲的設(shè)計(jì)，并經(jīng)過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而發(fā)明出更符合人們需求的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子程度上進(jìn)展設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰母拍罨蚬こ痰母拍睿夯蚬こ?，又叫DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的志愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳特性?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子程度剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)問題討論：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需求做哪些關(guān)鍵任務(wù)？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因經(jīng)過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合〞關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實(shí)際達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實(shí)際孟德爾提出基因的分別定律和自在組合定律根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實(shí)際摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實(shí)際艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實(shí)際沃森、克里克提出DNA的雙螺旋構(gòu)造模型。根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實(shí)際梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保管復(fù)制根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實(shí)際克里克等提出中心法那么DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實(shí)際1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。根底實(shí)際和技術(shù)開展催生了基因工程科技探求之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的勝利6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明處理培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需求哪些工具？“分子手術(shù)刀〞——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合〞關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針〞——DNA銜接酶“分子運(yùn)輸車〞——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的根本工具一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀〞1.主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分別純化產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成尋根問底他能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中構(gòu)成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的損害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證本身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而到達(dá)維護(hù)本身的目的。Goback⒉種類與命名：如今曾經(jīng)從約300種微生物中分別出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌〔Serratiamarcesens〕大腸桿菌〔EscherichiacoliR〕Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分別到3種限制酶，那么分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ磷酸二酯鍵T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+O限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵翻開構(gòu)成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，構(gòu)成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，構(gòu)成單個(gè)的脫氧核苷酸。Goback限制酶的識(shí)別序列：能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端反復(fù)演示Goback什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必需求用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。假設(shè)把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生一樣的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思索?……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段銜接起來生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一種DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底DNA銜接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸銜接到已有的核酸片段上，構(gòu)成磷酸二酯鍵構(gòu)成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間構(gòu)成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸經(jīng)過磷酸二酯鍵銜接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)銜接起來，不需求模板可把黏性末端之間的縫隙“縫合〞起來，E·coliDNA銜接酶或T4DNA銜接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA銜接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合〞起來，但效率較低T4DNA銜接酶二、“分子縫合針〞——DNA銜接酶①作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸銜接起來.②作用原理：催化磷酸二酯鍵構(gòu)成③類型：類型E·coliDNA銜接酶T4DNA銜接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能銜接黏性末端能銜接黏性末端和平末端(效率較低)一樣點(diǎn)差別三、“分子運(yùn)輸車〞——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需求的條件：⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)⑵對(duì)受體細(xì)胞無害⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)⑷有某些標(biāo)志基因，便于挑選⒉常用運(yùn)載體：⑴細(xì)菌的質(zhì)粒⑵λ噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒⑶假設(shè)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有料想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，假設(shè)沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，他會(huì)用它來做分子運(yùn)輸車嗎？⑷目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一同復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)志基因的存在，可用含氨芐青霉素的培育基鑒別思索與探求P7〔2〕為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列；或者經(jīng)過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，雖然細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使本身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體運(yùn)用的DNA分子很多都是質(zhì)?！瞤lasmid〕，即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。能否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體運(yùn)用呢？不是，作為基因工程運(yùn)用的載體必需滿足以下條件：思索與探求P71〕載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必需是在質(zhì)粒本身需求的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2〕載體DNA必需具備自我復(fù)制的才干，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3〕載體DNA必需帶有標(biāo)志基因，以便重組后進(jìn)展重組子的挑選。4〕載體DNA必需是平安的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5〕載體DNA分子大小應(yīng)適宜，以便提取和在體外進(jìn)展操作，太大就不便操作。實(shí)踐上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)展人工改造后才干用于基因工程操作。4、DNA銜接酶有銜接單鏈DNA的身手嗎？迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA銜接酶都不具有銜接單鏈DNA的才干，至于緣由，如今還不清楚，也許未來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以銜接單鏈DNA的酶。思索與探求P71.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需運(yùn)用〔〕同種限制酶B.兩種限制酶同種銜接酶D.兩種銜接酶A課堂練習(xí)2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制