有助于抗氧化檢驗(yàn)方法

有助于抗氧化檢驗(yàn)方法1動物實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)動物選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠，也可用氧化損傷模型鼠。單一性別，小鼠每組10-15只，大鼠8－12只。1.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)溶劑對照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，高劑量一般不超過30倍，必要時(shí)設(shè)陽性對照組、空白對照組。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長至45天。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1老齡動物選用10月齡以上大鼠或8月齡以上小鼠，按血中MDA水平分組，隨機(jī)分為1個(gè)溶劑對照組和3個(gè)受試樣品劑量組。3個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，對照組給予同體積溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動物測脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2D－半乳糖氧化損傷模型1.3.2.1原理D-半乳糖供給過量，超常產(chǎn)生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起過氧化效應(yīng)。1.3.2.2造模方法選25－30g健康成年小鼠，除空白對照組外，其余動物用D-半乳糖40mg－1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為0.1mL/10g，每日1次，連續(xù)造模6周，取血測MDA，按MDA水平分組。隨機(jī)分為1個(gè)模型對照組和3個(gè)受試樣品劑量組，3個(gè)劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，在給受試樣品的同時(shí)，模型對照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動物測脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3乙醇氧化損傷模型1.3.3.1原理乙醇大量攝入，激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2造模方法選25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，1個(gè)模型對照組和3個(gè)受試樣品劑量組，必要時(shí)可增設(shè)1個(gè)空白對照組。3個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30天，末次灌胃后，模型組對照組和3個(gè)劑量組禁食16小時(shí)（過夜然后1次性灌胃給予50%乙醇12mL/kgBW，6小時(shí)后取材（空白對照組不作處理，不禁食取材測血清或肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測定1.3.4.1血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量可采用熒光法和比色法測定，方法任選其一。MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過氧化的程度。1個(gè)丙二醛（MDA）分子與2個(gè)硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。以波長536nm為激發(fā)光，在550nm有最強(qiáng)熒光強(qiáng)度?？捎脽晒夥ㄟM(jìn)行微量測定。1.3.4.1.1.2儀器與試劑儀器：熒光分光光度計(jì)、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管試劑：10mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，棕色瓶4℃保存12個(gè)月臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸0.209gEDTA.2H2O25mg谷胱甘肽（還原型）1mg用0.02mol/LNaOH50mL溶解（微溫助溶，棕色瓶4℃保存2周）酸水解液0.1mol/LH2SO4125mL0.1mol/LNa2SO4125mL加水150mL用H2SO4調(diào)pH1.5，加水稀釋至500mL正丁醇以上所用玻璃器皿均需經(jīng)50%硝酸浸泡24h后，再經(jīng)蒸餾水、雙蒸水淋洗干燥，試劑（選AR級）最好用雙蒸水配制。全血上清液：取血50μL加入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測。血清樣品：取血0.5mL室溫靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液待測。1.3.4.1.1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將10nmol/mL四乙氧基丙烷，用雙蒸水稀釋成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分別取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混勻，避光、沸水浴60min→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液（正丁醇層）測熒光強(qiáng)度（入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm）以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。1.3.4.1.1.3.3樣品測定試劑空白管樣本管標(biāo)準(zhǔn)管10mL具塞離心管0.1mL蒸餾水0.1mL血清*0.1mL標(biāo)準(zhǔn)#酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻正丁醇3mL3mL3mL振蕩抽提1min，3000r/min離心5min*全血上清液0.5mL（空白管加蒸餾水0.5mL，標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)0.1mL、蒸餾水0.4mL）#1nmol/mL四乙氧基丙烷（標(biāo)準(zhǔn)）→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液（正丁醇層）測熒光強(qiáng)度（入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm）1.3.4.1.1.3.4計(jì)算公式：B-AB-A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血清）=???F-AF-AB-AB-A1過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血液）=???×C×K=———×1×————F-AF-A0.05A：空白管熒光度B：樣品熒光度F：四乙氧基丙烷熒光度C：四乙氧基丙烷濃度（1nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過氧化的程度。1個(gè)丙二醛（MDA）分子與2個(gè)硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長532nm有極大吸收峰。可用分光光度法進(jìn)行測定。1.3.4.1.2.2儀器與試劑儀器：可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管。試劑：0.2M乙酸鹽緩沖液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4℃保存3個(gè)月臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉1920mL0.2M磷酸二氫鉀480mL1.3.4.1.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.1.2.3.1樣品制備溶血液樣品：取血20μL加入0.98mL蒸餾水制成2%溶血液。1.3.4.1.2.3.2樣品測定試劑空白管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管2%溶血液*0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。*若用血清，樣品管0.15mL，標(biāo)準(zhǔn)管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計(jì)算B–AB–A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL2%溶血液）=????×C×K=—————×40×1F–AF–AB–AB–A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血清）=????×C×K=—————×40×1F–AF–AA:空白管吸光度B：樣品吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)1.3.4.2組織中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定1.3.4.2.2儀器與試劑儀器：可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器試劑：見1.3.4.1.2.21.3.4.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.2.3.1樣品制備組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成10%組織勻漿（W/V3000r/min離心5－10min，取上清液待測。1.3.4.2.3.2樣品測定試劑空白管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管10%組織勻漿0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行1.3.4.2.3.3計(jì)算B-AB-A1過氧化脂質(zhì)含量=????×C×K=———×40×—————————（nmol/mg組織）F-AF-A0.2×10%×1000A：空白管吸光度B：樣品管吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)1.3.4.3血清中8-表氫氧-異前列腺素（8-Isoprostane）測定8-表氫氧-異前列腺素（8-Isoprostane）是體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)穩(wěn)定而具有特異性的標(biāo)志物，其含量能間接反應(yīng)因機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而導(dǎo)致組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。1.3.4.3.2儀器與試劑儀器：酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機(jī)試劑：8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標(biāo)準(zhǔn)品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman’s試劑1.3.4.3.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.3.3.1樣品制備小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，3000r/min離心10min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用。1.3.4.3.3.2樣品測定按試劑盒說明操作。8-表氫氧-異前列腺素標(biāo)準(zhǔn)孔濃度分別為：500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12.8pg/mL、5.1pg/mL、2.0pg/mL、0.8pg/mL步驟試劑空白NSBB0標(biāo)準(zhǔn)/樣品1.加試劑EIA緩沖液--100μL50μL-標(biāo)準(zhǔn)/樣品----50μLAChE示蹤物--50μL50μL50μL抗體血清---50μL50μL2.培養(yǎng)用封板膜蓋好酶標(biāo)板，并在4℃避光條件下培養(yǎng)18小時(shí)3.清洗清洗所有反應(yīng)孔五次4.加試劑AChE示蹤物-5μL---Ellman’s200μL200μL200μL200μL200μL5.培養(yǎng)用封板膜蓋好酶標(biāo)板，并在常溫避光條件下培養(yǎng)45－90分鐘6.讀數(shù)在波長412nm處測量各孔吸光度（B0在0.3－1.0A.U范圍）標(biāo)準(zhǔn)或樣品孔吸光度—NSB孔吸光度%B/B0=——————————————————×100B0孔吸光度—NSB孔吸光度以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對數(shù)（log）為橫坐標(biāo)，%B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，亦可將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。將樣品的%B/B0值，代入方程式，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中的8-表氫氧-異前列腺素濃度。1.3.5蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測定H2O2或O2·ˉ自由基對蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈，使肽鏈斷裂，引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)羰基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度。蛋白質(zhì)羰基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，它隨著年齡的增長而增加。1.3.5.1血清中蛋白質(zhì)羰基測定被氧化后的蛋白質(zhì)羰基含量增多，羰基可與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙，2,4-二硝基苯腙為紅棕色的沉淀，將沉淀用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計(jì)上讀取370nm下的吸光度值，從而測定蛋白質(zhì)的羰基含量。1.3.5.1.2儀器與試劑儀器：紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、混旋器、2mL離心管。試劑：10mmol/L2,4-二硝基苯肼(DNPH)99mg2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸胍無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1：1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.1.3操作步驟試劑測定管對照管血清（血漿）10mmol/L2，4-二硝基苯肼0.4mL2mol/LHCL0.4mL渦旋混勻1分鐘，37℃準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸0.5mL0.5mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL1.25mL混勻后，37℃準(zhǔn)確水浴15分鐘渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調(diào)零，測定OD值。用雙縮脲法測定血清（或血漿）蛋白質(zhì)含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.5.1.4計(jì)算公式測定管OD-對照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105（nmol/mgprot）22×比色光徑（cm）×樣本蛋白濃度（mg/L）1.3.5.2組織中蛋白質(zhì)羰基測定見1.3.5.1.11.3.5.2.2儀器與試劑儀器：紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、天平、勻漿器、低溫高速離心機(jī)、混旋器、2mL離心管。試劑：10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38gN-2-羥乙基哌嗪-2’-乙磺酸（HEPES）溶入1000mL雙蒸餾水，用lNNaOH調(diào)pH至7.4，4℃保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素，溶入10mL雙蒸餾水，4℃避光保存。10mmol/L2，4-二硝基苯肼(DNPH)99mg2，4-二硝基苯肼用50mL2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸胍無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1：1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.5.2.3.1樣品處理取0.1g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加入0.9mL的冰的10mmol/LHEPES緩沖液（pH7.4制成10%的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min，保留上清。取100g/L的硫酸鏈霉素溶液50μL，加入上清液450μL（v/v,1:9室溫放置10min后，以11000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min，取上清液待測。1.3.5.2.3.2操作步驟試劑測定管對照管組織勻漿上清液10mmol/L2，4-二硝基苯肼0.4mL2mol/LHCL0.4mL渦旋混勻1分鐘，37℃準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸0.5mL0.5mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0mL1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL1.25mL混勻后，37℃準(zhǔn)確水浴15分鐘渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調(diào)零，測定OD值。用雙縮脲法測定勻漿上清液蛋白質(zhì)含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.5.2.3.3計(jì)算公式測定管OD-對照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105（nmol/mgprot）22×比色光徑（cm）×樣本蛋白濃度（mg/L）1.3.5.3注意事項(xiàng)1.3.5.3.1加入硫酸鏈霉素：在勻漿上清液中加入硫酸鏈霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些堿基如鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，這些堿基就會與DNPH結(jié)合，并反應(yīng)生成有色物質(zhì)，這些物質(zhì)會增加最后溶液的吸光度，使結(jié)果偏大。1.3.5.3.2DHPH的溶解：DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀堿等溶液，因此，用2mol/LHC1來溶解DNPH。設(shè)對照管是為了避免HC1與反應(yīng)液中一些物質(zhì)反應(yīng)生成對比色有影響的物質(zhì)。1.3.5.3.3反應(yīng)體系應(yīng)避光：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中加入DNPH進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系需置于黑暗中，因?yàn)镈NPH不穩(wěn)定，見光會分解。如果反應(yīng)體系遇到光，DNPH分解，體系中會有剩余的沒有變成蛋白質(zhì)腙衍生物，對反應(yīng)比色有影響。1.3.5.3.4去除未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH：由于DNPH在370nm左右有強(qiáng)烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反復(fù)洗滌沉淀，去掉未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH，否則，會增加吸光值。1.3.6抗氧化酶活力測定SOD催化超氧陰離子自由基（O2·ˉ)生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除O2·ˉ對細(xì)胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動物某些器官和人體血紅細(xì)胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。1.3.6.1血或組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力測定O2·ˉ氧化羥胺的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長530nm處有極大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行測定，當(dāng)SOD消除O2·ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。1.3.6.1.2儀器與試劑儀器可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.810mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2g/L黃嘌呤氧化酶取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲萘胺取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸餾水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸餾水至200mL0.33%對氨基苯磺酸取0.66g對氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸餾水，加50mL冰醋酸至200mLSOD標(biāo)準(zhǔn)品三氯甲烷95%乙醇（v/v）0.9%生理鹽水1.3.6.1.3實(shí)驗(yàn)步驟紅細(xì)胞抽提液制備：10μL全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95%乙醇0.1mL，振蕩30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min離心3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行三次，制成1%組織勻漿最好用超聲波發(fā)生器處理30s使線粒體振破，以中性紅－詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min，取上清液20μL待測。SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL（1.5μg/mL用本法測定不同量的SOD標(biāo)準(zhǔn)液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以SOD活力單位U/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照管OD－測定管ODSOD百分抑制率＝-----------------×100%對照管OD計(jì)算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位。（對照管OD-測定管OD）×100%對照管OD反應(yīng)液總量（6mL）SOD活力（U/mL------------------×------------×樣品稀釋倍數(shù)50%取液量也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細(xì)胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。樣品測定步驟：試劑測定管對照管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8（mL）樣品A*10mmol/L鹽酸羥胺（mL）7.5mmol/L黃嘌呤（mL）0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶（mL）雙蒸水（mL）0.10.20.20.490.10.20.20.49混勻，37℃恒溫水浴30min0.33%對氨基苯磺酸（mL）0.1%甲萘胺（mL）2.02.02.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測定OD值。20－30μL（溶血樣品剔除）1.3.6.2血或組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來表示，GSH和5,5’-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。1.3.6.2.2試劑和儀器儀器：可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑：疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0，4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽（還原型GSH）溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1－2日。1.25－1.5mmol/LH2O2溶液取30%H2O20.15－0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4℃避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTA16.7g（先用蒸餾水溶解）0.5gNaCl280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過濾，室溫保存。0.32mol/LNa2HPO4溶液:Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB40mg檸檬酸三鈉1.0g加蒸餾水至100mL，4℃避光保存1個(gè)月。0.2M磷酸緩沖液pH7.40.9%生理鹽水1.3.6.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.6.2.3.1樣品制備溶血液：取鼠血10μL加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測，4h內(nèi)測定酶活力。若當(dāng)天來不及測定，將肝素抗凝全血置-20℃凍存，3d內(nèi)測定，若4℃存放，28h內(nèi)必須測完。測前取出樣品室溫自然解凍。組織上清液：動物禁食過夜，處死后，立即取出所需臟器，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎塊，稱取適量組織，加冷0.2M磷酸緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)3次制成5%組織勻漿，操作在冰浴中進(jìn)行，勻漿以12500×g離心10min（低溫高速離心機(jī)以沉淀為破碎的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、核及線粒體，上清液用以測胞液中的酶活力，最好當(dāng)天測，否則加20%（v/v）甘油分裝于塑料管，放置-20－-80℃,可保存數(shù)周，而酶活力不減。1.3.6.2.3.2GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑8mL，用雙蒸水稀釋至10mL刻度，即得到濃度為0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液。取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液各2mL，放入試管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯，5min內(nèi)在可見光423nm波長測OD值，以雙蒸水調(diào)零點(diǎn)。以GSH含量(μmol/L）為橫坐標(biāo)，OD423值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.6.2.3.3測定步驟：試劑樣品管（mL）非酶管（mL）空白管（mL）1.0mmol/LGSH0.40.4樣品**0.4雙蒸水*0.437℃水浴預(yù)溫5minH2O2（37℃預(yù)熱）0.20.237℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)3min（嚴(yán)格控制時(shí)間）偏磷酸沉淀液443000r/min離心10min離心上清液雙蒸水偏磷酸沉淀液0.32mol/LNa2HPO4DTNB顯色液222.50.52.50.50.50.42.50.5顯色反應(yīng)1min后于423nm波長（1cm光徑讀OD值，5min之內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.6.2.3.4計(jì)算鼠全血GSH-Px活力單位規(guī)定每1mL全血，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1為一個(gè)酶活力單位。非酶管log[GSH]-樣品管log[GSH]鼠全血GSH-Px活力單位（U/mL全血）=────────────────3min×0.004mLlog[非酶管OD－空白管OD]-log[樣品管OD-空白管OD]=────────────────────────3min×0.004mL組織GSH-Px比活力單位規(guī)定每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)，使GSH濃度降低1μmol/L為一個(gè)酶活力單位。（非酶管OD－樣品管OD）×A**×5組織GSH-Px比活力單位（U/mg蛋白）=───────────────────3min×樣品蛋白質(zhì)的mg數(shù)*標(biāo)準(zhǔn)GSH濃度(μmol/L）1.3.6.2.4注意事項(xiàng)1.3.6.2.4.1由于H2O2易分解導(dǎo)致濃度改變，臨用時(shí)取貯備液用分光光度計(jì)測其濃度，取貯備液3mL，測定1cm光徑的240nm處OD值。OD濃度（mmol/L）=????????0.036（消光系數(shù)）若OD值為0.45，則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。1.3.6.2.4.25-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個(gè)反應(yīng)體系中氫離子濃度有關(guān)，還受反應(yīng)時(shí)間限制。加入顯色劑后，反應(yīng)體系pH為6.5時(shí)，11min開始顯色，此時(shí)比色5min內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。1.3.7抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）測定谷胱甘肽是一種低分子清除劑，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，是GSH-Px和GST兩種酶類的底物，為這兩種酶分解氫過氧化物所必需，它能穩(wěn)定含巰基的酶，和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用，GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1血或組織中還原型谷胱甘肽（GSH）測定方法GSH和5,5'-二硫?qū)ο趸姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于420nm波長有最吸收峰，測定該離子濃度，即可計(jì)算GSH的含量。1.3.7.1.2儀器和試劑儀器：可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑：0.9%生理鹽水4%磺基水楊酸溶液0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0稱取Na2HPO413.452g，KH2PO40.722g，加蒸餾水至1000mL。0.004%DTNB溶液：稱取DTNB40mg溶于1000mL的0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0）中。疊氮納緩沖液：NaN316.25mgEDTA-Na27.44mgNa2HPO41.732gNaH2PO41.076g加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0，4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取還原型GSH15.4mg，加疊氮納緩沖液至50mL，終濃度為1mmol/L，臨用前配制。1.3.7.1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.7.1.3.1樣品制備：溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加雙蒸水0.9mL（1：9溶血液充分混勻，直至透亮為止。取溶血液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水楊酸0.1mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。組織上清液：取組織0.5g加生理鹽水4.5mL充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿混勻后取漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。1.3.7.1.3.2樣品測定：溶血液或組織樣品測定：測定管空白管上清液0.5mL-4%磺基水楊酸-0.5mLDTNB4.5mL4.5mL混勻，室溫放置10分鐘后，420nm處測定吸光度。血清樣品測定：測定管空白管上清液-4%磺基水楊酸-DTNB0.9mL0.9mL混勻，室溫放置10分鐘后，420nm處測定吸光度。注：該指標(biāo)檢測，需新鮮樣品取材后當(dāng)天完成。用雙縮脲法測定血清（或溶血液）、組織勻漿蛋白質(zhì)含量。如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.7.1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線取1mmol/LGSH標(biāo)準(zhǔn)溶液0、10、20、50、100、150、200μL，分別加入生理鹽水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液系列，各管加入DTNB4.5mL，混勻，室溫放置10分鐘后，空白管調(diào)零，420nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。12345671mmol/LGSH（mL）00.010.020.050.100.150.20生理鹽水（mL）0.500.490.480.450.400.350.30DTNB（mL）4.504.504.504.504.504.504.50GSH量(μmol/L）020402003004001.3.7.1.3.4計(jì)算樣品GSH含量(μmol/L全血）樣品GSH含量(μmol/L血清）=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×溶血液稀釋倍數(shù)×上清液稀釋倍數(shù)=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×10×2=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×上清液稀釋倍數(shù)=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×2樣品GSH含量(μmol/g組織）樣品GSH含量(μmol/gprot）=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×上清液稀釋倍數(shù)÷上清液組織含量=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×2÷100g組織/L=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×上清液稀釋倍數(shù)÷上清液蛋白含量=對應(yīng)曲線濃度值(μmol/L）×2÷勻漿gprot/L1.4數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定1.4.1數(shù)據(jù)處理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.4.2指標(biāo)判定1.4.2.1脂質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，過氧化脂質(zhì)（丙二醛或8-表氫氧-異前列腺素）含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有降低脂質(zhì)過氧化作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.2蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，蛋白質(zhì)羰基含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有降低蛋白質(zhì)過氧化作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.3抗氧化酶活力受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，抗氧化酶（SOD或GSH-Px）活力升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化酶活力作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.4抗氧化物質(zhì)GSH受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，GSH含量升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化物質(zhì)GSH作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.3結(jié)果判定過氧化脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)羰基、抗氧化酶活性、還原型谷胱甘肽四項(xiàng)指標(biāo)中三項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品有助于抗氧化動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。2人體試食試驗(yàn)2.1受試者納入標(biāo)準(zhǔn)選年齡在18－65歲，身體健康狀況良好，無明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患，無長期服藥史，志愿受試保證配合的人群。2.2排除受試者標(biāo)準(zhǔn)2.2.1妊娠或哺乳期婦女，對保健食品過敏者。2.2.2合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病患者。2.2.3短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對結(jié)果的判斷者。2.2.4不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定食用受試樣品，無法判定功效或資料不全影響功效或安全性判斷者。2.3受試者分組對受試者按MDA、SOD、GSH-Px水平隨機(jī)分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習(xí)慣等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4試驗(yàn)方法采用自身和組間兩種對照設(shè)計(jì)。試驗(yàn)組按推薦服用方法、服用量每日服用受試產(chǎn)品，對照組可服用安慰劑或采用陰性對照。受試樣品給予時(shí)間3個(gè)月，必要時(shí)可延長至6個(gè)月。試驗(yàn)期間對照組和試食組原生活、飲食不變。2.5觀察指標(biāo)各項(xiàng)指標(biāo)在試驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)各檢測1次。2.5.1安全性指標(biāo)2.5.1.1一般狀況包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查2.5.2功效指標(biāo)2.5.2.1過氧化脂質(zhì)含量觀察試驗(yàn)前后MDA的變化及MDA下降百分率。（測定方法見1.3.4.1）MDA下降百分率=試驗(yàn)前MDA—試驗(yàn)后MDA試驗(yàn)前MDA觀察試驗(yàn)前后8-Isoprostane的變化及8-Isoprostane下降百分率。（測定方法見2.8）8-Isoprostane下降百分率=試驗(yàn)前8-Isoprostane—試驗(yàn)后8-Isoprostane試驗(yàn)前8-Isoprostane2.5.2.2超氧化物歧化酶觀察試驗(yàn)前后SOD的變化及SOD升高百分率。（測定方法見1.3.6.1）試驗(yàn)后SOD—試驗(yàn)前SODSOD升高百分率=試驗(yàn)前SOD2.5.2.3谷胱甘肽過氧化物酶觀察試驗(yàn)前后GSH-Px的變化及GSH-Px升高百分率。（測定方法見2.7）試驗(yàn)后GSH-Px—試驗(yàn)前GSH-PxGSH-Px升高百分率=×100%試驗(yàn)前GSH-Px2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定凡自身對照資料可以采用配對t檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，后者需進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；但變異系數(shù)太大（如CV>50%）的資料應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。在試驗(yàn)前組間比較差異無顯著性的前提下，可進(jìn)行試驗(yàn)后組間比較。各功效觀察指標(biāo)試驗(yàn)前后自身比較和試食后組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方可判定該指標(biāo)陽性。過氧化脂質(zhì)含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有有助于抗氧化作用。2.7血中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力測定2.7.1原理谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來表示，GSH和5，5’-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。2.7.2試劑和儀器儀器：可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、微量加樣器、離心機(jī)試劑：疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCL、NaOH調(diào)pH7.0，4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽（還原型GSH）溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1－2日。1.25－1.5mmol/LH2O2溶液取30%H2O20.15－0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4℃避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTANaCl16.7g（先用蒸餾水溶解）0.5g280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過濾，室溫保存。0.32mol/LNa2HPO4溶液:Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB40mg檸檬酸三鈉1.0g加蒸餾水至100mL，4℃避光保存1個(gè)月。2.7.3實(shí)驗(yàn)步驟2.7.3.1樣品制備溶血液：取血20μL加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測，4小時(shí)內(nèi)測定酶活力。若當(dāng)天來不及測定，將肝素抗凝全血置-20℃凍存，3天內(nèi)測定，若4℃存放，