HPLC方法開(kāi)發(fā)-流動(dòng)相的選擇課件

HPLC方法開(kāi)發(fā)

——流動(dòng)相的選擇HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇1.流動(dòng)相的一般要求

流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力流動(dòng)相具有一定惰性流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)純度高流動(dòng)相的黏度要盡量小流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑流動(dòng)相配置好后要進(jìn)行過(guò)濾流動(dòng)相配制好后要進(jìn)行脫氣HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇2.常用溶劑的重要性質(zhì)

極性黏度沸點(diǎn)紫外截止波長(zhǎng)HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇常用溶劑參數(shù)表SolventPolarityViscosity(cp20℃)BoilingPoint(℃)UVCutOff(nm)Hexane(正己烷)0.060.3369210Carbontetrachloride(四氯化碳)1.600.9777265Toluene(甲苯)2.400.59111285Benzene(苯)3.000.6580210Methylenechloride(二氯甲烷)3.400.4440245n-propanol(異丙醇)4.002.2798210Tetrahydrofuran(四氫呋喃)4.200.5566220Ethanol(乙醇)4.301.2079210Chloroform(氯仿)4.400.5761245Acetone(丙酮)5.400.3257330Acetonitrile(乙腈)6.200.3782190Dimethylformamide(二甲基甲酰胺)6.400.92153270Methanol(甲醇)6.600.6065205Ethyleneglycol(乙二醇)6.9019.90197210Dimethylsulfoxide(二甲亞砜)7.202.24189260Water10.201.00100210HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇3.過(guò)濾

溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇4.脫氣氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇5.溶劑過(guò)濾器的防護(hù)溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長(zhǎng)會(huì)堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞。

（1）嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過(guò)濾（2）勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液（3）避免使溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過(guò)濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用蒸餾水沖洗干凈。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇6．流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器內(nèi)，不要貯存在塑料容器中。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧及塵埃溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存超過(guò)規(guī)定的有效期。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇7．HPLC實(shí)驗(yàn)用水HPLC實(shí)驗(yàn)用水除滿足藥典對(duì)純化水

一般要求外，還需要滿足以下要求：

項(xiàng)目指標(biāo)電阻率，MΩ·cm，25℃，最小18.0總有機(jī)碳（TOC)，mg/L，最大0.5微粒，μm濾器0.22

HPLC級(jí)水增加紫外加吸收要求：在1cm池中，用HPLC級(jí)水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過(guò)0.01、0.01和0.05。

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇8.等度洗脫

在反相色譜中，極性越強(qiáng)的溶劑洗脫能力越弱。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，組分極性有一定差別的樣品，多用于含量測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：基線平穩(wěn)，保留時(shí)間重現(xiàn)性好，對(duì)流動(dòng)相純度要求低。缺點(diǎn)：較早洗脫出的色譜峰時(shí)分離度差，較晚洗脫出的色譜峰展寬理論塔板數(shù)低。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇9.梯度洗脫

梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多樣品。優(yōu)點(diǎn)：

縮短分析時(shí)間提高分離度改善峰形提高檢測(cè)靈敏度缺點(diǎn)：

增加基線漂移較長(zhǎng)平衡時(shí)間

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇9.梯度洗脫

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

每次梯度洗脫之后必須10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值

反相離子抑制技術(shù)：采用反相色譜法分離弱酸或弱堿樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的解離平衡常數(shù)Ka值越小，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，流動(dòng)相的pH值越大，組分的Ka值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于弱堿的pKa值時(shí)，弱堿主要以分子形式存在；分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用10～50mmol/L磷酸鹽緩沖液，0.05%TFA；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用10mmol/L三乙胺溶液，0.05~0.5%NH4OH。

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值當(dāng)溶液pH值等于化合物的pKa時(shí)，化合物半解離。在pKa±1.5的范圍內(nèi)，保留隨pH值的變化而發(fā)生明顯變化。超過(guò)此pH值范圍，化合物完全解離或不解離，保留隨pH值的變化很小。了解化合物的pKa值，可在pKa±2的范圍外調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，使化合物有較好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇11.緩沖鹽HPLC用緩沖鹽時(shí),由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng),容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。清洗液配制:90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長(zhǎng)和減小水的表面張力。當(dāng)鹽溶液與有機(jī)溶劑溶液混合時(shí)，鹽溶液能與有機(jī)溶劑溶液完全混溶，而不會(huì)出現(xiàn)沉淀。但是在比例閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來(lái)，因此此時(shí)應(yīng)該在進(jìn)液口位于混合器下方放置含鹽流動(dòng)相進(jìn)液口位于混合器上方放置不含鹽流動(dòng)相；HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇11.緩沖鹽緩沖劑pKa緩沖范圍UV截止波長(zhǎng)nm磷酸鹽2.11.1-3.1200(0.1%)7.26.2-8.212.311.3-13.3檸檬酸鹽3.12.1-6.4230(10mM)4.75.4甲酸鹽3.82.8-4.8210(10mM)乙酸鹽4.83.8-5.8210(10mM)氨水9.28.2-10.2200(10mM)三乙胺1110.0-12.0200(10mM)HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇12.離子對(duì)試劑作用原理：離子對(duì)試劑與待分析的物質(zhì)（多為在溶液狀態(tài)時(shí)顯以與離子對(duì)試劑相反的電荷）結(jié)合成離子對(duì)而呈中性，這樣非極性就表現(xiàn)出來(lái)，從而在色譜柱上有保留行為。試劑選擇：分析酸性（作用基團(tuán)）樣品一般用陽(yáng)離子對(duì)試劑（四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨），分析堿性樣品用陰離子對(duì)試劑（己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉……十二烷基磺酸鈉）離子對(duì)的分離機(jī)制------離子對(duì)模型樣品離子首先在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成不荷電的疏水性離子對(duì)，然后溶解或吸附于非極性固定相上。離子對(duì)試劑的烷基C鏈越長(zhǎng)，生成的離子對(duì)與固定相的親和力越大，因此組分的保留值也越大。使用離子對(duì)試劑濃度盡可能的低（一般0.005mol/L)，

以

保證對(duì)柱子填料的穩(wěn)定性影響最小及清洗方便。

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇12.離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑使用注意的因素有：1、離子對(duì)的濃度，這個(gè)一般情況下在滿足要求的前提下

越低越好。2、離子對(duì)溶液的pH，這個(gè)是進(jìn)行分離的最關(guān)鍵的因素，而只能在緩沖液中測(cè)定pH,不要混合有機(jī)相后測(cè)定。3、如果使用離子對(duì)試劑，一定注意平衡時(shí)間，正常的話在60-90分鐘才能達(dá)到徹底的平衡，還有在實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后要沖洗超過(guò)2個(gè)小時(shí)，否則柱子可能會(huì)不可逆的損傷。4、用離子對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所用的柱子盡量和其他的非離子對(duì)的分開(kāi)使用。

HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求

13.1UV：截止波長(zhǎng):將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長(zhǎng)。中國(guó)藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度：

在220~240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40

在241~250nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.20

在251~300nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.10

在300nm以上不得過(guò)0.05HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求13.2ELSDELSD對(duì)流動(dòng)相的組成不敏感，可以用于梯度洗脫；ELSD要求流動(dòng)相要蒸發(fā)掉，因此不能使用不易揮發(fā)的物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值。HPLC方法開(kāi)發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求13.3MSD由于鹽對(duì)質(zhì)譜的損傷很大