免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化實(shí)驗(yàn)方法整理ppt免疫組織化學(xué)的概念利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反響使標(biāo)記抗體的顯色劑〔熒光素、酶、金屬離子、同位素〕顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原〔多肽和蛋白質(zhì)〕，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。2整理ppt最突出的優(yōu)點(diǎn)在更廣闊的范圍內(nèi)，把結(jié)構(gòu)與功能及代謝結(jié)合起來，在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，到達(dá)方法統(tǒng)一，定性可靠，定位準(zhǔn)確，定量可能。3整理ppt免疫組化實(shí)驗(yàn)標(biāo)本組織標(biāo)本〔石蠟切片和冰凍切片〕細(xì)胞標(biāo)本〔組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片〕。石蠟切片對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔；4整理ppt細(xì)胞和組織的固定1．固定的作用--使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固、終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，最大限度地保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?．選擇最正確固定液的標(biāo)準(zhǔn)：保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；保存抗原性?！?〕醛類固定劑：穿透性較強(qiáng)，收縮性小，是常用的固定劑。如10％中性福爾馬林液、4％多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等?！?〕非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛混合使用?！?〕丙酸及醇類固定劑：沉淀蛋白質(zhì)和糖，保存抗原性較好。但對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3．常用的固定方法--浸入法和灌注法〔適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究〕組織新鮮勿枯燥體積適中固定液足夠〔>20倍〕5整理ppt抗體常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。特性比較：均一性2.穩(wěn)定性 3.特異性4.重復(fù)性5.沉淀反響6整理ppt熒光素標(biāo)記抗體能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素。必備條件:③熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色比照鮮明，能清晰判斷結(jié)果。④結(jié)合抗體蛋白后對(duì)抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響，用于活體內(nèi)標(biāo)記，結(jié)合物應(yīng)無毒，附加抗原性小。7整理ppt常用的染色方法根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法按標(biāo)記物定位于抗原所在部位的手段，那么可將免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色方法分為直接法〔一步法〕、間接法〔二步法〕、橋連法等。每進(jìn)行一步結(jié)合反響。都會(huì)產(chǎn)生一次陽性結(jié)果的放大效應(yīng)。敏感性由高到低依次為橋連法、間接法、直接法。8整理ppt染色的根本程序①標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反響結(jié)合；②用緩沖液洗去未結(jié)合的成分；③直接觀察結(jié)果；或顯色后再用顯微鏡觀察。9整理ppt反響條件抗原抗體結(jié)合屬于可逆性反響，具有共性的反響條件：〔1〕PH：中性及弱鹼性條件〔PH7～8〕有利于免疫復(fù)合物的形成〔2〕離子強(qiáng)度：0.01～0.02M的低離于強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成〔3〕去污劑：有利于復(fù)合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20，EDTA〔0.01%〕，TritonX-100〔0.1～1%〕〔4〕抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度：稀釋液中含無關(guān)蛋白質(zhì)可以減少抗體的非特異吸附，常用牛血清白蛋白〔5〕防腐劑：微生物生長(zhǎng)會(huì)干擾抗原抗體反響，稀釋液和抗體液中參加適量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐〔6〕溫度和時(shí)間：較高的反響溫度〔37℃〕可加速抗原抗體結(jié)合反響，低溫有利于抗原抗體結(jié)合率的提高〔7〕洗滌：除去未結(jié)合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色。選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10整理ppt熒光素1，異硫氰酸熒光黃〔fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC〕黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。最常用。2．四甲基異硫氰酸羅丹明〔tetramethylrhodamineisothiocyante，TRITC〕紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光比照鮮明。3．四乙基羅丹明〔tetraethylrhodamineB200，RB200〕褐紅色粉未，最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596～600nm，呈橙紅色熒光。價(jià)廉。11整理ppt染色本卷須知〔1〕在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以免標(biāo)本上的試劑枯燥?！?〕酸堿度以接近體液環(huán)境為宜〔PH7.4左右〕〔3〕組織細(xì)胞要求新鮮，最好使用冷凍切片，固定存檔標(biāo)本要求組織結(jié)構(gòu)完好?！?〕切片經(jīng)染色后，應(yīng)及時(shí)觀察并照相。切片在4℃冰箱內(nèi)過夜，其熒光強(qiáng)度將減弱約30％?！?〕調(diào)整抗體稀釋度以獲得最正確染色效果，以背景非特異性染色最小為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每一批抗體必須試驗(yàn)摸索，找出最正確稀釋度?！?〕所購(gòu)抗體應(yīng)及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù)。12整理ppt酶標(biāo)抗體法通過共價(jià)鍵將酶結(jié)合在抗體上制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞或組織外表或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察。常用的酶--辣根過氧化物酶〔HRP〕，堿性磷酸酶〔ALP〕及葡萄糖氧化酶〔GOD〕等。優(yōu)點(diǎn)：與免疫熒光技術(shù)相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長(zhǎng)久保存，經(jīng)鋨酸處理后，電子密度增強(qiáng)，可用于電鏡觀察。13整理ppt抗生物素-生物素-過氧化物酶技術(shù)

(avidin-biotinperoxidasecomplexABC)原理：利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第2抗體和生物素標(biāo)記的酶。其第1抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接。ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反響而制備的。常用：ABC-HRP辣根過氧化物酶：最通用的系統(tǒng)，使用范圍廣ABC-AP堿性磷酸酶：靈敏度比較高，染色密度較低ABC-GO葡萄糖氧化酶：靈敏度較低，適用于組織內(nèi)源性HRP或者AP含量比較高的組織，常與HRP或者AP系統(tǒng)配合進(jìn)行雙染14整理ppt15整理pptABC法的特點(diǎn)：敏感性強(qiáng)特異性強(qiáng)，背景染色淡方法簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間可用于雙重或多重免疫染色。16整理ppt免疫金染色原理：

免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗體，然后在光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)抗原。解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的問題。整個(gè)檢測(cè)過程中無需酶的參與，因此不必預(yù)先處理樣本以消除內(nèi)源性酶的活性。17整理ppt免疫組化試劑的正確選擇和使用18整理ppt一抗1.首選單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w具有高特異性、高親和力、交叉反響少等特點(diǎn)，防止與細(xì)胞或組織蛋白的非特異性結(jié)合，減少染色背景。2.多克隆抗體：最好是經(jīng)樣本來源種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉液〔可以是BSA或二抗來源的正常動(dòng)物血清〕充分封閉，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。3.跨膜分子的抗體選擇：要注意免疫原是整個(gè)蛋白分子或是胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。對(duì)于胞內(nèi)區(qū)抗體，染色時(shí)需要使用穿孔劑，而胞外區(qū)抗體不必使用。4.正確使用：一般供給商都會(huì)提供稀釋范圍和使用方法。但常常需要重新選擇比例。一般從供給商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作倍比稀釋。19整理ppt二抗種屬來源要匹配：根據(jù)所用一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應(yīng)選擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬?gòu)V譜Ig或針對(duì)一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠IgG1,可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供給商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作5倍比稀釋。20整理ppt設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照----證明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的正確性1.陽性對(duì)照：主要涉及所用緩沖液、稀釋液、二抗和檢測(cè)系統(tǒng)等因素。尤其在結(jié)果出現(xiàn)無信號(hào)時(shí)，為查找原因提供重要線索。2.陰性對(duì)照：一種是自身對(duì)照〔常用〕，指測(cè)試組織本身非抗原表達(dá)部位。一種是外部對(duì)照，指已證實(shí)不表達(dá)檢測(cè)抗原的組織。21整理ppt試劑保存------抗體試劑保存：抗體濃度越高越穩(wěn)定，易保存；濃度低時(shí)，應(yīng)