HPLC分析方法的建立與開發(fā)

建立分析方法1精選2021版課件色譜分離度與分離性能2精選2021版課件HPLC分離的機(jī)理3精選2021版課件色譜工作者關(guān)心的基本問題-色譜峰之間的分離度totRAmAUtimetRBR=分離度tRA=組分A的保留時(shí)間tRB=組分B的保留時(shí)間w=峰的基線寬度w1/2=半峰寬4精選2021版課件分離度值5精選2021版課件等梯度洗脫的基本分離度公式N:總的理論塔板數(shù);柱效k:容量因子(保留因子),色譜峰的保留作用α：色譜峰的相對分離程度;選擇性作用6精選2021版課件影響分離度的因素7精選2021版課件容量因子對分離度的影響8精選2021版課件容量因子-----流動(dòng)相組成的影響9精選2021版課件選擇性10精選2021版課件影響選擇性的參數(shù)降低增加較弱的溶劑較強(qiáng)的溶劑異丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超載不容易超載改變流動(dòng)相組成改變固定相有機(jī)成分含量低的固定相有機(jī)成分含量高的固定相11精選2021版課件色譜柱溫度對分離度的影響12精選2021版課件柱效13精選2021版課件計(jì)算柱效14精選2021版課件典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱內(nèi)徑mm(5um粒度)mL/minflowrate2=i.d.2i.d.12flowrate115精選2021版課件柱外體積的影響10μL20μLTime,min.2.1x150mmF=0.2mL/min.樣品體積連接管路的體積檢測器體積檢測器電子線路的時(shí)間常數(shù)16精選2021版課件所需分離度與柱長匹配17精選2021版課件峰對稱性18精選2021版課件提高分離度增大k'增加選擇性提高柱效19精選2021版課件分離度與k,n和的關(guān)系20精選2021版課件液相色譜流動(dòng)相及固定相21精選2021版課件流動(dòng)相

與GC流動(dòng)相不同，HPLC流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，又和固定相一起參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。1、

理想的溶劑應(yīng)有下列特性1）化學(xué)穩(wěn)定性好，與固定相不互溶、不發(fā)生反應(yīng)2）必須和檢測器相適應(yīng)★使用UV檢測器時(shí)，溶劑截止波長要小于測量波長★使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別22精選2021版課件3）對待測物具一定極性和選擇性4）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截止波長增加；盡量避免使用有顯著毒性的溶劑5）適宜的粘度★粘度過高，柱壓增加★過低（例：戊烷、乙醚等），易產(chǎn)生氣泡23精選2021版課件2、溶劑的極性溶劑的極性強(qiáng)弱用溶劑強(qiáng)度參數(shù)表示，強(qiáng)度參數(shù)值越大，表示溶劑的洗脫能力越大。序號溶劑紫外波長極限（nm）序號溶劑紫外波長極限（nm）1異辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六環(huán)2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氫呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水20024精選2021版課件3、流動(dòng)相的選擇4、梯度洗脫特點(diǎn)：可以縮短總的色譜周期，提高分離效能，改善峰形，減少拖尾，可以增加靈敏度，會(huì)引起基線漂移25精選2021版課件固定相化學(xué)鍵合固定相方法：通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面形成柱填（約有3/4以上分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行）特點(diǎn)：穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗分離機(jī)理：兼有吸附、分配兩種分離模式。化學(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主。

26精選2021版課件

載體主要是硅膠（表面有硅醇基）,特點(diǎn)為：?可以制備成粒度分布窄的多種粒度?機(jī)械強(qiáng)度好，可以填充成穩(wěn)定、高效的填充床?長期高壓操作下不變形?反壓較低、柱壽命長?較其它材料制成的柱有更高的柱效?適用于小分子、大分子的分析和制備?高pH值下會(huì)分解（pH＜8）27精選2021版課件鍵合方法：（l）硅酯化（≡Si-O-R）鍵合固定相（2)硅氮型（=Si-N=）共價(jià)鍵合固定相（3）硅烷化（≡Si-O-Si-R）鍵合固定相使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題?硅膠鍵合相的穩(wěn)定性?鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性?鍵合相色譜分離的選擇性?鍵合相色譜柱的再生

28精選2021版課件化學(xué)鍵合相色譜法29精選2021版課件正相色譜和反相色譜反相色譜的定義：在非極性的固定相上，用極性較大的液體作流動(dòng)相進(jìn)行物質(zhì)分離分析的方法。即：反相色譜中鍵合固定相的極性要小于流動(dòng)相的極性正相色譜的定義：在極性的固定相上，用極性較小的液體作流動(dòng)相進(jìn)行物質(zhì)分離分析的方法。即：正相色譜中鍵合固定相的極性要大于流動(dòng)相的極性30精選2021版課件正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜的差別：正相色譜反相色譜固定相極性大小流動(dòng)相極性小至中等中至大組分流出順序極性小的組分先流出極性大的組分先流出流動(dòng)相極性增大保留時(shí)間變小保留時(shí)間變大分離組分油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物非極性、極性或離子型化合物31精選2021版課件正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系32精選2021版課件正相鍵合相色譜法固定相：正相色譜中采用極性鍵合固定相，是把全多孔（或薄殼）微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理制成表面含有大量硅羥基的載體后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有胺基、腈基、醚基的極性固定相。

33精選2021版課件流動(dòng)相：在非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。34精選2021版課件反相鍵合相色譜法

采用非極性鍵合固定相,是把全多孔(或薄殼)微粒硅膠載體,經(jīng)酸活化處理后,和含有烷基鏈或苯基的硅烷化試劑反應(yīng),生成表面具有烷基(或苯基)的非極性固定相，如C18、C835精選2021版課件流動(dòng)相：流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，可用于分離極性化合物若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)36精選2021版課件硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響

時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。37精選2021版課件分析方法建立38精選2021版課件分析時(shí)要了解的情況想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---儀器制造商的文獻(xiàn)充分了解自己的樣品對色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法39精選2021版課件分析時(shí)要了解的情況（續(xù)1）靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?40精選2021版課件分離(制備)時(shí)要了解的情況要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?41精選2021版課件什么化合物參數(shù)能用于分離?分子量不同/MW>2000凝膠滲透/凝膠過濾

離子化分子

離子對/離子交換

極性不同

吸附/反相色譜

同系物/苯系物

反相

中性、酸和堿的混合物 反相

生物分子

親和/HIC/凝膠過濾/反相

立體異構(gòu)體

吸附

手性化合物

手性色譜結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)收集?固定相和流動(dòng)相選擇42精選2021版課件一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k值改變保留值調(diào)節(jié)α值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度記住∶

每次改變一個(gè)參數(shù)43精選2021版課件使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）44精選2021版課件色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速45精選2021版課件常規(guī)樣品分離的系統(tǒng)方法46精選2021版課件總的指導(dǎo)原則改變可以明顯改善選擇性的條件避免會(huì)影響方法普適性的實(shí)際問題減少必要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，盡可能地利用計(jì)算機(jī)模擬選擇適用于各種常規(guī)試樣的實(shí)驗(yàn)，以便采用同樣的方法建立未知樣品（離子的或中性）的HPLC分析方法先做簡單易行的實(shí)驗(yàn)（改變色譜柱、改變pH、使用復(fù)雜的混合溶劑等屬于比較難做的條件）47精選2021版課件反相HPLC分離的總體方案設(shè)計(jì)1、確定樣品是屬于常規(guī)的還是特殊的特殊樣品包括：無機(jī)離子對映體生物分子合成的高分子碳水化合物異構(gòu)體48精選2021版課件2、選擇分離條件，進(jìn)行第一次分離分離變量最佳的初始選擇柱填料C8

或C18柱結(jié)構(gòu)15cm*4.6mm或25cm*4.6mm，5μm流速1.0ml/min（或2.0ml/min）流動(dòng)相乙腈—水（中性樣品）乙腈---緩沖液（離子型樣品）（緩沖液為25--50mM磷酸緩沖液，pH2～3）對初始試驗(yàn)：5→100%B梯度溫度常溫進(jìn)樣量＜50μL（20μL）49精選2021版課件選擇流動(dòng)相在反相色譜中常用水/乙腈pH的選擇思路選低pH可以使柱硅羥基質(zhì)子化并降低其色譜活性低pH與常見酸堿官能團(tuán)的pKa值相差較遠(yuǎn)，組分在此條件下的tR受pH變化影響小

初期應(yīng)避免使用三乙胺和離子對試劑等添加劑

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品

過濾樣品

安裝色譜柱

沖洗柱，平衡

平衡檢測器

進(jìn)樣

分析結(jié)果!第一次

HPLC運(yùn)行50精選2021版課件!第一次

HPLC運(yùn)行選擇逐步方法開發(fā)步驟用強(qiáng)洗脫液開始等梯度洗脫，此后每次運(yùn)行降低洗脫液強(qiáng)度嘗試運(yùn)行梯度51精選2021版課件!第一次

HPLC運(yùn)行

無峰/響應(yīng)

分離度差的峰第一次運(yùn)行得到的結(jié)果可能:

檢測方法不正確

濃度太稀提高進(jìn)樣濃度，或者在無色譜柱的條件下注射少量樣品改變流動(dòng)相優(yōu)化系統(tǒng)得到了色譜峰-是 -否檢查

HPLC系統(tǒng)52精選2021版課件3、做初次運(yùn)行并根據(jù)譜圖將樣品分類

0.5<k<20等度洗脫可行，超出此范圍等度洗脫可行的樣品建議用梯度洗脫的樣品53精選2021版課件反相保留太弱的樣品改變pH、加入離子對試劑、改變柱子、改用正相色譜強(qiáng)保留樣品用非水反相或正相條件復(fù)雜樣品54精選2021版課件4、對等度方法，用初始梯度運(yùn)行來估計(jì)第二次等度運(yùn)行的最佳B%5、評價(jià)第二次運(yùn)行中峰的質(zhì)量--柱效、峰寬、峰形★峰太寬或不對稱：要改變初始的分離條件（柱子、pH、添加劑等）★運(yùn)行情況良好：平行實(shí)驗(yàn)，保證柱平衡和可重復(fù)的保留時(shí)間55精選2021版課件6、對等度方法，可以改變ACN%來改善峰間距和分離度★若有必要，ACN改為MeOH，并根據(jù)峰間距和分離度優(yōu)化MeOH%★可以進(jìn)一步混合ACN和MeOH成為三元溶劑系統(tǒng)，并優(yōu)化7、若6方法中分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件56精選2021版課件8、對梯度方法，用改變梯度變化速度和柱溫來優(yōu)化峰間距和分離度★結(jié)果滿意，可以按等度分離方法優(yōu)化溶劑類型★分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件9、對梯度方法，改變初始和最后的B%、梯度變化速度、梯度形狀可以改善分離度或縮短運(yùn)行時(shí)間10、對等度或梯度方法，改變一個(gè)柱條件（柱長、流速、填料尺寸）可以提高分離度或降低運(yùn)行時(shí)間57精選2021版課件等度分離方法58精選2021版課件反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4.6mm×15cm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱（或走梯度）流速：1ml/min樣品：①對羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)59精選2021版課件改變?nèi)萘恳蜃覭(改變比例)①對羥基苯甲酸甲酯②對羥基苯甲酸丙酯③對羥基苯甲酸丁酯通過改變流動(dòng)相比例改變選擇性60精選2021版課件改變選擇性∶α通過改變流動(dòng)相組成改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑61精選2021版課件固定相優(yōu)化：改變色譜柱0246810120246810121234567891012456789103C-18C-8Optimization62精選2021版課件10種巴比妥藥物的分離（等梯度）保留時(shí)間(min)3.14

相對吸光度4.555.746.447.117.7410.7611.7912.631巴比妥2阿洛巴比妥3阿普比妥4苯巴比妥5異丁比妥6環(huán)戊巴比妥7布他比妥8海索比妥9異戊巴比妥10甲苯比妥25%乙腈1245678910111231363精選2021版課件優(yōu)化流動(dòng)相-困難的分離01020304050607080901000204060801000201040305060708090100乙腈/水甲醇/水四氫呋喃/水甲醇1467253四氫呋喃乙腈1.從甲醇/水開始，優(yōu)化溶劑組成以使所有色譜峰在合理的

k范圍流出.2.選擇洗脫強(qiáng)度相等的乙腈/水混合流動(dòng)相進(jìn)行下一次分析.3.用四氫呋喃/水流動(dòng)相重復(fù)分析4.按比例混合等強(qiáng)度流動(dòng)相再進(jìn)行進(jìn)樣分析

優(yōu)化64精選2021版課件三種流動(dòng)相的比較25%乙腈35%甲醇21%異丙醇洗脫順序

選擇性65精選2021版課件離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽離子使用反相柱通過改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性加入“對離子”，使樣品呈中性66精選2021版課件離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8內(nèi)67精選2021版課件如果： 一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化 一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用“離子對色譜法”68精選2021版課件分離弱離子化化合物的初始實(shí)驗(yàn)條件水相緩沖液/乙腈可變(k=0.5～20)分離變量初始選擇尺寸粒度鍵合相15(或25)x0.46cm5或3.5μmC18或

C8溶劑

A和

B（%B）溫度體積質(zhì)量40°C20μL<25μg色譜柱流動(dòng)相樣品量流速1-2mL/min添加劑需要時(shí)，25-50Mm三乙胺緩沖液25mM磷酸鉀,pH￡369精選2021版課件緩沖液緩沖液

pKa

緩沖范圍

緩沖液

pKa

緩沖范圍磷酸 甲酸 3.8 2.8～4.8

pK1 2.1 1.1～3.1 乙酸 4.8 3.8～5.8

pK2 7.2 6.2～8.2 Tris(三羥甲基氨基甲烷)

pK3 12.311.3～13.3 8.3 7.3～9.3檸檬酸 硼酸 9.2 8.2～9.3

pk1 3.1 2.1～4.1 吡咯10.59.5～11.5pK2 4.7 3.7～5.7氨 9.2 8.2～10.2pK3 5.4 4.4～6.4其他常用的流動(dòng)相添加劑磷酸三氟乙酸(TFA)甲酸70精選2021版課件離子對色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型季銨鹽、叔胺鹽（正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負(fù)離子），適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同71精選2021版課件離子對反相HPLC分離陰離子流動(dòng)相

A和B含有離子對試劑C和D是純緩沖液72精選2021版課件離子對色譜的應(yīng)用

抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治?3精選2021版課件離子對色譜分析水溶性維生素74精選2021版課件優(yōu)化離子對HPLC優(yōu)化參數(shù)

流動(dòng)相的

pH

離子對試劑濃度

離子對試劑選擇

流動(dòng)相組成75精選2021版課件方法開發(fā)的其他因素流速對柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進(jìn)樣量(濃度)對柱效的影響樣品的進(jìn)樣體積對柱效的影響溶劑粘度對柱效的影響 以上因素均影響分離度76精選2021版課件梯度方法77精選2021版課件梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？78精選2021版課件梯度的洗脫方式79精選2021版課件復(fù)雜樣品的一般流出問題早流出峰的分離度差遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k范圍寬，所以分析時(shí)間長.強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫

-在洗脫樣品的整個(gè)過程中，流動(dòng)相的組成保持不變.80精選2021版課件一種解決方案----梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)

改善分離度

提高檢測性能

能夠分離復(fù)雜樣品

縮短分析時(shí)間

降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜柱性能變差的可能性梯度洗脫-在分離過程中改變流動(dòng)相組成.梯度的其他應(yīng)用

柱清洗

方法開發(fā)中的嘗試運(yùn)行

81精選2021版課件梯度方法開發(fā)---優(yōu)化溶劑梯度5%有機(jī)相100%有機(jī)相從嘗試運(yùn)行開始-一個(gè)平緩的梯度

流速

柱長

柱重新平衡時(shí)間需要確定的因數(shù):

有機(jī)溶劑

初始組成

梯度時(shí)間

梯度陡度

梯度形狀82精選2021版課件選擇梯度陡度010203040min.100%B100%B0%B0%BtG=40tG=20100%B100%B0%B0%BtG=10tG=5010陡平緩83精選2021版課件HPLC測定17種氨基酸舉例-AQC衍生流動(dòng)相A：稱取NaAc·3H2O19.04g(或無水NaAc11.48g)溶解于1000ml純水中，用1：1的稀磷酸溶液調(diào)節(jié)PH到約5.2，加1mlEDTA－2Na溶液，精確加入三乙胺2.37ml或稱取1.72g，邊加邊攪拌，用稀磷酸調(diào)節(jié)PH：紫外檢測pH＝4.95；熒光檢測PH＝5.02，用0.45μm濾膜過濾，備用。使用之前超聲波脫氣20分鐘流動(dòng)相B：乙腈/水＝3：2，再加0.1～0.25ml丙酮/1000ml,混勻。使用之前超聲波脫氣20分鐘84精選2021版課件HPLC測定17種氨基酸舉例-AQC衍生HPLC條件流動(dòng)相A：流動(dòng)相B梯度表

steptime(min)Flow(ml/min)A%001.01001151.0932201.0853280.8724340.7675391.006421.007431.01008531.0100

檢測波長：248nm(熒光檢測EX=250nm;EM=395nm)柱溫：37

C進(jìn)樣量：10μl85精選2021版課件17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸HPLC分析-UV檢測86精選2021版課件梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)87精選2021版課件梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間∶6分鐘平衡時(shí)間∶7分鐘平衡時(shí)間∶8分鐘平衡時(shí)間∶9分鐘＆平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足＆8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足

88精選2021版課件梯度陡時(shí),使用短色譜柱(降低

Vm)常常能改善分離度4.6x50mm

1. GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-?蛋白質(zhì)

AMYLOIDFRAGM1-16 4. [TYR8]血管舒緩激肽 5. MET-ENK 6. 亮氨酸腦菲肽 7. 血管緊張肽

II 8. KINETENSIN 9. 核糖核酸酶 10. INS(EQUINE)4.6x150mm12345678910min.k*=2.5k*=2.6k*=4.5k*=5.90161284C8,3.5μm梯度: 2-75%Bin30min.流動(dòng)相: A=5:95,ACN:H2O0.1%TFA B=95:5,ACN:H2O0.085%TFA流速: 1mL/min.進(jìn)樣: 10μL,每種組分2.6μg溫度: 35°CUV: 215nm89精選2021版課件儀器對梯度性能的影響死體積=從梯度形成到柱頭的體積提高起始濃度將縮短分離時(shí)間,但由于死體積和形成梯度前的等度步驟，將使分離更依賴于儀器—泵的滯后體積越小越好.死體積90精選2021版課件定性及定量方法91精選2021版課件

保留值定性的主要方法

★直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照★某一未知峰和已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值完全相同—可能是★改變色譜柱或流動(dòng)相，保留時(shí)間仍完全相同—基本是定性方法92精選2021版課件利用文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比和定性分析

注意HPLC的柱填充技術(shù)的復(fù)雜性，定性受到限制93精選2021版課件最簡單的方法：標(biāo)準(zhǔn)添加法

前提：要有標(biāo)準(zhǔn)物

判斷的標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)樣后，使未知樣色譜峰增高，改變色譜條件，未知峰仍能增高94精選2021版課件PDA，光譜圖比較、譜庫檢索確認(rèn)色譜峰的純度

-保證每個(gè)色譜峰下只有一個(gè)被測的組份

-檢查是否有共流出的物質(zhì)（雜質(zhì)）干擾色譜峰純度確認(rèn)的方法

-用光電二極管矩陣檢測器比較光譜圖

-峰純度鑒定，四波長比例95精選2021版課件MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索96精選2021版課件定量分析定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測定檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法97精選2021版課件（一）定量分析基礎(chǔ)1.定量分析的基本公式定量分析的目的：

要確定樣品中某一組分的準(zhǔn)確含量，是一種相對的定量方法

定量分析的方法：

在某些限定條件下，檢測器響應(yīng)值（色譜峰的峰面積或峰高）---所測組分的數(shù)量或濃度成正比，98精選2021版課件即：

式中：---組分i的質(zhì)量

—組分i的濃度

—組分的校正因子（與檢測器的性質(zhì)和被測組分的性質(zhì)有關(guān)）

—組分i的峰面積，

—組分i的峰高99精選2021版課件2.定量校正因子的測定（1）絕對校正因子（fi)★

fi的物理意義:單位峰面積所代表的I組分的量是一個(gè)與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測器的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)★定量校正因子的計(jì)算公式為：

式中：Ai

、hi—i組分的峰面積、峰高

mi

、Ci–-i組分的質(zhì)量、濃度100精選2021版課件（2）相對校正因子（校正因子）：式中：f--相對校正因子，簡稱為校正因子，無因次量

fi,fs—i物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)（s）的質(zhì)量（或濃度)Ai(hi),As(hs)---物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（或峰高）101精選2021版課件質(zhì)量校正因子(fm)

定義：當(dāng)物質(zhì)量用質(zhì)量來表示時(shí)的校正因子稱為質(zhì)量校正因子(fm),表示單位峰面積所代表的組分質(zhì)量，質(zhì)量一般用g或mg表示.

式中：mi,ms-被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量

Ai,As-被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積

102精選2021版課件（3）校正因子的實(shí)驗(yàn)測量方法

★樣品的準(zhǔn)備：測定校正因子時(shí)，要精密稱定適量被測組分對照品和基準(zhǔn)物質(zhì)，配制成已知準(zhǔn)確濃度的樣品。

★樣品的測定：在已確定的色譜條件下，量取樣品進(jìn)樣，從譜圖上獲得準(zhǔn)確的峰面積

★計(jì)算：根據(jù)相對校正因子的計(jì)算公式可以算出質(zhì)量校正因子103精選2021版課件（二）定量方法1.歸一化法

★定義：把所有出峰的組分含量之和按100%計(jì)的定量方法稱為歸一化法，是一種相對定量方法?！锴疤幔簶悠分械乃薪M分都能流出色譜柱，而且在檢測器上所有的組分都能產(chǎn)生信號。計(jì)算方法：

式中：Ai—組分i的峰面積

fi—組分i的質(zhì)量校正因子法。104精選2021版課件★優(yōu)點(diǎn)：簡便、準(zhǔn)確★缺點(diǎn)：校正因子的測定比較麻煩★注意：

▼主要用于GC的定量測定，當(dāng)fi相近時(shí)，可直接用峰面積歸一化法。

▼由于檢測技術(shù)的影響,HPLC中很少使用歸一化105精選2021版課件2、外標(biāo)法

是色譜定量分析中比較常用的一種方法，是絕對定量方法。106精選2021版課件計(jì)算方法：用濃度～峰面積（峰高）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其斜率即為絕對校正因子要求：回歸線性方程

計(jì)算相關(guān)系數(shù)107精選2021版課件用單點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算：

依據(jù)：色譜的定量基礎(chǔ)108精選2021版課件特點(diǎn)：★簡便、快速、適合于大量樣品的分析★無需各組份都被檢出、洗脫★需要標(biāo)樣★標(biāo)樣及樣品測定的條件要一致★進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確

★對樣品前處理過程中待測組分的變化無法補(bǔ)償。

109精選2021版課件3.內(nèi)標(biāo)法

待測組分(i)的含量mi為：式中：Ai(hi)、As(hs)—待測組分i和內(nèi)標(biāo)物s的峰面積（峰高）

fi、fs—待測組分i對照品和內(nèi)標(biāo)物s的絕對校正因子

f—相對校正因子，由待測組分i的對照品和內(nèi)標(biāo)物s測定110精選2021版課件實(shí)際色譜圖111精選2021版課件關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：A、內(nèi)標(biāo)物必須是原樣品中不存在的物質(zhì)，其性質(zhì)盡量與待測組分相近(同系物、異構(gòu)體)B、內(nèi)標(biāo)物不能和被測組分起化學(xué)反應(yīng)，要能完全溶于被測樣品中；C、內(nèi)標(biāo)物的峰盡可能接近待測組分的峰，或位于幾個(gè)待測組分的中間，但必須和樣品中的所有峰完全分離；D、內(nèi)標(biāo)物的加入量應(yīng)和待測組分相近。112精選2021版課件內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)：

★進(jìn)樣量或色譜條件有微小變化時(shí)對定量結(jié)果影響不大

★可部分補(bǔ)償待測組分在樣品前處理時(shí)的損失

★若加入幾種內(nèi)標(biāo)物，還可提高定量分析的精度。

★內(nèi)標(biāo)物的選擇比較困難，同時(shí)內(nèi)標(biāo)物稱量要求準(zhǔn)確，操作麻煩。113精選2021版課件4.標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法

★是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，★把待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加入到待測樣品中★在相同的色譜條件下，測定加入待測組分純物質(zhì)前、后待測組分的峰面積（或峰高）★計(jì)算出待測組分在樣品中的含量。114精選2021版課件具體做法：第一步：在確定的色譜條件下，測定樣品中待測組分(i)的峰面積或峰高，Ai(hi);第二步：在第一步所用樣品中準(zhǔn)確加入已知量為△mi的待測組分(i)，同樣條件下測出峰面積或峰高，Ai’(hi’)；第三步：根據(jù)定量基本公式mi=fi×Ai(hi)計(jì)算115精選2021版課件

mi=fi×Ai(hi)（前）

mi+△mi=fi’×Ai’(hi’)（后）

mi—原樣品中待測組分(i)的量116精選2021版課件標(biāo)準(zhǔn)加入法的特點(diǎn)①不需另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做內(nèi)標(biāo)，僅需有待測組分的純物質(zhì)②進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性影響不大，操作簡單③若在樣品前處理之前就加入已知準(zhǔn)確量的待測組分，則可完全補(bǔ)償待測組分在前處理過程中的損失④要求加入待測組分前后兩次色譜測定的色譜條件完全相同，才能保證兩次測定時(shí)的校正因子完全相等