第16章中藥制劑和生化藥物分析簡(jiǎn)介

第十六章中藥制劑和生化藥物分析簡(jiǎn)介定義：中藥制劑是根據(jù)中醫(yī)藥理論和用藥原那么，將單味或多味中藥材按規(guī)定的處方和方法加工制成具有一定規(guī)格，可以直接用于防病、治病的單方或復(fù)方制劑。中藥的成方制劑又稱為中成藥。第一節(jié)中藥制劑分析簡(jiǎn)介

注意：中藥制劑分析必須是以中醫(yī)藥根底理論和用藥原那么為指導(dǎo)運(yùn)用現(xiàn)代分析理論和方法進(jìn)行的質(zhì)量分析。二、中藥制劑分析的特點(diǎn)1、有效成分的難確定性

中醫(yī)藥理論：整體觀念協(xié)同作用質(zhì)量分析：根據(jù)中醫(yī)藥理論進(jìn)行綜合分析2、化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性〔1〕每一味中藥本身就是一個(gè)混合物：人參：僅人參皂苷類成分就有幾十種之多；還有多糖、揮發(fā)油等成分?！?〕化學(xué)成分之間的相互影響：黃連黃芩、甘草、金銀花配伍小檗堿能和黃芩苷、甘草酸、綠原酸形成難溶于水的復(fù)合物而沉淀析出3、中藥制劑原料藥材質(zhì)量的差異〔1〕原料藥材的品種、規(guī)格、產(chǎn)地、藥用部位、采收季節(jié)、加工方法的影響

GAP中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)麻黃東北→西北〔-〕麻黃堿含量↑〔+〕麻黃堿含量↓丹參酮：11、12月份含量最高薄荷腦：秋季葉變黃時(shí)含量最高葛根：野葛不得小于2.4%粉葛不得少于0.3%葛根素含量差異很大不同部位人參皂苷的含量重量比(%)總皂苷含量(%)周皮6.92.60韌皮46.63.04木質(zhì)部46.50.31〔2〕炮制方法的影響

草烏：酯型生物堿的含量與炮制條件有關(guān)延胡索：醋制，醋的濃度對(duì)總生物堿的溶出率有較大影響4、評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量，應(yīng)以中醫(yī)藥

理論為指導(dǎo)原那么中藥制劑的組方有君、臣、佐、使之分；質(zhì)量分析〔1〕著重分析君藥、臣藥；貴重藥、劇毒藥。例：黃連上清丸：黃連是主藥安宮牛黃丸：黃連是輔藥〔2〕中醫(yī)臨床功能主治與現(xiàn)代藥理學(xué)相結(jié)合進(jìn)行分析例：山楂：健胃消食制劑中測(cè)有機(jī)酸含量活血止痛治療心血管疾病測(cè)黃酮類成分丸、散、片、錠、合、酒、酊、膏、露、茶、栓、顆粒、糖漿等5.中藥制劑工藝及輔料的特殊性〔1〕劑型繁多，制備工藝各異有效成分與濃縮枯燥方法的關(guān)系(%)常壓減壓逆浸透成分濃縮濃縮噴霧大黃酸葡萄糖苷41.151.696.8小檗堿34.537.594.5黃連堿6.312.093.7黃岑苷77.477.698.5三黃瀉心湯干浸膏

針對(duì)不同的劑型，采用相應(yīng)的方法進(jìn)行別離純化后測(cè)定〔2〕輔料種類多，干擾大蠟丸蜂蠟蜜丸蜂蜜糊劑糯米粉、黃米粉曲劑發(fā)酵膠劑豆油、黃酒、冰糖6、中藥制劑雜質(zhì)來(lái)源的多途徑性7、中藥制劑有效成分的非單一性中藥制劑的分類二、中國(guó)藥典〔2000年版〕一部〔二十六種〕丸劑膠劑膏藥顆粒劑滴眼劑散劑合劑露劑糖漿劑軟膏劑片劑酒劑茶劑滴丸劑注射劑錠劑酊劑搽劑膠囊劑滴鼻劑栓劑巴布膏劑橡膠膏劑氣霧劑噴霧劑煎膏劑〔膏滋〕流浸膏劑與浸膏劑（一）液體制劑用藥材提取物制備的液體制劑合劑、糖漿劑、酒劑、茶劑、酊劑滴鼻劑、滴眼劑、露劑、搽劑等〔無(wú)植物組織與細(xì)胞，故無(wú)顯微鑒別〕1、合劑與口服液〔單劑量合劑也可稱為“口服液〞〕pH裝量相對(duì)密度微生物限度一般檢查項(xiàng)目合劑系指藥材用水或其他溶劑，采用適宜方法提取，經(jīng)濃縮制成的內(nèi)服液體制劑2、酒劑與酊劑酒劑酊劑含乙醇量（GC）甲醇量檢查（GC）總固體裝量微生物限度一般檢查項(xiàng)目藥材用蒸餾酒提取制成的澄清液體制劑藥物用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑（二）半固體制劑軟膏裝量微生物限度檢查項(xiàng)目常用基質(zhì)油脂性、水溶性乳劑型〔乳膏劑〕藥物、藥材細(xì)粉、藥材提取物與適量基質(zhì)混合制成的半固體外用制劑藥材提取液的濃縮液（三）半流體制劑煎膏劑(膏滋)流浸膏劑與浸膏劑〔半流體或固體〕〔無(wú)植物組織與細(xì)胞，故無(wú)顯微鑒別〕藥材用水煎煮、去渣濃縮后，加煉蜜或糖制成的半流體制劑1、煎膏劑(膏滋)相對(duì)密度不溶物裝量微生物限度檢查項(xiàng)目應(yīng)無(wú)焦臭、異味，無(wú)糖結(jié)晶析出2、流浸膏劑與浸膏劑（半/固）藥材用適宜的溶劑提取，蒸去局部或全部溶劑，調(diào)整濃度至規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)而制成的制劑裝量微生物限度檢查項(xiàng)目1ml流浸膏——1g原藥材1g浸膏——2~5g原藥材生產(chǎn)提取溶劑大多為水或稀醇檢測(cè)時(shí)一般需經(jīng)有機(jī)提取后分析〔1〕有效成清楚確且有適當(dāng)方法，測(cè)定有效成分的含量〔2〕有效成分不明或無(wú)定量方法的，可測(cè)一定溶劑的浸出物含量〔3〕對(duì)于流浸膏，有的測(cè)總固體量以控制其質(zhì)量（四）固體制劑藥材提取物、藥材粉末加賦形劑、制備而成丸劑、膠劑、顆粒劑、散劑、片劑、膠囊劑、錠劑、膠劑、茶劑、栓劑〔有植物組織與細(xì)胞，可做顯微鑒別〕三、中藥制劑分析的一般程序及方法取樣鑒別含量測(cè)定檢查提取純化〔一〕取樣原那么：均勻合理方法：〔1〕抽取樣品法：樣品量大〔2〕圓椎四分法：樣品量小供試品溶液的制備（二）1、提取方法（1）萃取法利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解度的不同，使物質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，將測(cè)定組分提取出來(lái)的方法正丁醇——用于皂苷類醋酸乙酯——用于黃酮類氯仿——用于生物堿類乙醚、石油醚——用于揮發(fā)油1〕萃取溶劑的選擇2〕水相pH的選擇酸性成分——比其pKa低1~2個(gè)pH單位堿性成分——比其pKa高1~2個(gè)pH單位〔3〕儀器和提取次數(shù)〔4〕酒劑和酊劑——先揮去乙醇〔5〕防止和消除乳化分液漏斗鑒別——1次含量測(cè)定——3~4次（2、）冷浸法樣品置溶劑里，室溫下浸泡一段時(shí)間的提取方法適宜易溶出的組分適宜遇熱不穩(wěn)定的藥物費(fèi)時(shí)（8~24小時(shí)）特點(diǎn)適用范圍適宜植物性粉末不宜動(dòng)物性粉末親脂性←→親水性石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水（3）回流提取法樣品置有機(jī)溶劑中加熱回流的提取方法加快溶出速度，省時(shí)適宜受熱穩(wěn)定的藥物適宜較難溶出的組分特點(diǎn)儀器普通回流裝置通過(guò)更換溶劑，使提取更完全（4）、連續(xù)回流提取法樣品置有機(jī)溶劑中加熱，蒸發(fā)的溶劑經(jīng)冷凝流回樣品管的提取方法節(jié)省溶劑，提高提取效率適宜受熱穩(wěn)定的藥物費(fèi)時(shí)特點(diǎn)儀器索氏提取器（5）、水蒸氣蒸餾法適用于具揮發(fā)性的可隨水蒸氣蒸出的組分的測(cè)定麻黃堿、檳榔堿、丹皮酚、揮發(fā)油（6）、超聲提取法超聲波振蕩器〔超聲波清洗器〕簡(jiǎn)便省時(shí)提取率高

利用超聲波的助溶作用進(jìn)行提取原理超聲波在液體中以疏密相間的形式向物體輻射，出現(xiàn)“空化〞現(xiàn)象〔氣泡的形成、產(chǎn)生及破裂現(xiàn)象〕，形成超過(guò)1000個(gè)大氣壓的沖擊力（7）、超臨界流體萃取〔SFE法〕當(dāng)壓力和溫度超過(guò)氣體的臨界點(diǎn)時(shí)所形成的單一相態(tài)超臨界流體是一種處于超臨界點(diǎn)之上的流體，是介于氣體與液體之間的一種物相，兼有氣體與液體的一些特性氣體超臨界流體氣體T↓壓力↑T↑壓力↓超臨界流體萃取與化學(xué)法萃取相比有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：1〕它具有與液體相似的密度，因而具有與液體相似的較強(qiáng)的溶解能力；2〕溶質(zhì)在流體中的擴(kuò)散系數(shù)與氣體相似，具有傳質(zhì)快，提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)；3〕超臨界流體的外表張力為零，易滲透到樣品中，帶走測(cè)定組分；4〕超臨界流體在通常狀態(tài)下為氣體，萃取后溶劑可立即變成氣體而逸出，易到達(dá)濃集的目的；5〕CO2是一種不活潑的氣體,萃取過(guò)程不發(fā)生化學(xué)反響,且屬于不燃性氣體,無(wú)味、無(wú)臭、無(wú)毒，故平安性好；6〕CO2價(jià)格廉價(jià)，純度高，容易取得，且在生產(chǎn)過(guò)程中循環(huán)使用，從而降低本錢；7〕該技術(shù)易與其他儀器聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化2、純化方法〔1〕、萃取法利用藥物與雜質(zhì)溶解性能的不同進(jìn)行別離例生物堿鹽氨水H2O〔2〕柱色譜法〔1〕保存測(cè)定組分在柱上，洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗下組分〔2〕保存雜質(zhì)于柱上常用固定相硅膠氧化鋁大孔吸附樹(shù)脂鑒別試驗(yàn)〔三〕、首選有效成分黃連小檗堿〔抗菌消炎〕麻黃麻黃堿〔支氣管哮喘〕烏頭烏頭堿〔毒性〕洋地黃強(qiáng)心苷〔強(qiáng)心〕延胡索延胡索乙素〔鎮(zhèn)痛〕1、顯微鑒別〔含生藥粉制劑〕丸劑、片劑、膠囊劑、散劑快速，簡(jiǎn)便，覆蓋面大選擇原則（1）應(yīng)選有專屬性的特征進(jìn)行鑒別（2）多來(lái)源的藥材應(yīng)選擇共有的特征進(jìn)行鑒別1、水牛角濃縮粉2、麝香3、珍珠4、朱砂5、雄黃6、黃連7、梔子8、郁金9、黃芩安宮牛黃丸2、化學(xué)鑒別抗干擾能力差顯色、↓、↑、熒光例二妙丸中蒼術(shù)的鑒別蒼術(shù)酮蒼術(shù)炔3、色譜鑒別TLC法——應(yīng)用最多〔Rf、顏色、熒光〕GC法——適用于含揮發(fā)性成分的藥物HPLC法——常與含量測(cè)定同時(shí)進(jìn)行〔1〕陰、陽(yáng)對(duì)照法陽(yáng)性對(duì)照將要鑒別的藥材按制劑工藝處理，再按鑒別方法提取的溶液陰性對(duì)照把制劑中要鑒別的藥材除去，用剩下的各味藥按制劑工藝處理，再按鑒別方法提取的溶液

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陰樣陽(yáng)對(duì)品對(duì)例大補(bǔ)陰丸黃柏的TLC法鑒別樣品對(duì)照藥材小檗堿O

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例〔2〕對(duì)招品對(duì)照法〔3〕對(duì)照藥材對(duì)照法薄層板的選擇硅膠G板〔可加0.3%~0.5%CMC-Na〕——多用氧化鋁板——常用于生物堿類藥物聚酰胺板——常用于黃酮類及酚類藥物纖維素板——常用于氨基酸類藥物〔1〕定義：中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)定該中藥材或中藥制劑特性的共有峰的圖譜4、中藥鑒別新技術(shù)－中藥指

紋圖譜〔2〕.色譜指紋圖譜的根本屬性整體性將指紋圖譜作為一個(gè)整體來(lái)分析和比較它的綜合特征以到達(dá)鑒別的目的。模糊性強(qiáng)調(diào)分析、比較指紋圖譜的相似性，而不是完全相同。是一種綜合的、量化的色譜鑒別手段。色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中能夠盡可能多地反響中藥的全貌。不需要清楚每一個(gè)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；不需要對(duì)每一個(gè)組分都進(jìn)行定量；只要求不同批號(hào)的同一種藥品的指紋圖譜保持一致?！?〕.指紋圖譜的應(yīng)用雅蓮云蓮味蓮雅蓮云蓮IIIIII訶子小訶子大訶子絨毛訶子人參須根人參主根不同產(chǎn)地高良姜的氣相指紋圖譜指紋圖譜研究過(guò)程中的本卷須知：1、在藥效學(xué)指導(dǎo)下進(jìn)行研究，保證指紋圖譜反映的化學(xué)成分包括中藥材中有效部位所含的絕大局部成分或有效成分的全部。2、樣品的預(yù)處理過(guò)程及測(cè)定方法應(yīng)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、易行，且專屬性、準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性好。雜質(zhì)檢查（四）、水分總灰分和酸不溶性灰分重金屬砷鹽殘留農(nóng)藥主要工程雜質(zhì)來(lái)源及檢查意義水分——結(jié)塊、霉變或有效成分水解灰分——控制藥物本身及泥土、沙石等無(wú)機(jī)雜質(zhì)砷鹽——?jiǎng)《?，常由除草劑、殺蟲劑或化肥引入重金屬——環(huán)境污染和使用農(nóng)藥引入殘留農(nóng)藥——有毒烘干法〔不含或少含揮發(fā)性成分〕甲苯法〔含揮發(fā)性成分〕減壓枯燥法〔含揮發(fā)性成分貴重藥〕GC法1、水分測(cè)定法酸不溶性灰分的測(cè)定△△總灰分的測(cè)定2、總灰分和酸不溶性灰分的測(cè)定WHO規(guī)定植物藥鉛≤10ppm鎘≤0.3ppm干法破壞濕法破壞硫代乙酰胺法3、重金屬的測(cè)定干法破壞〔ChP〕濕法破壞〔USP〕△△(調(diào)到中性)△堿融法破壞濕法破壞堿融法H+4、砷鹽的測(cè)定5、殘留農(nóng)藥的測(cè)定1、總氯量的測(cè)定2、總磷量的測(cè)定3、GC法中國(guó)藥典中藥制劑含量測(cè)定所占比例版本%19771.4819855.3119908.73199512.81200062.09〔HPLC36%TLCS24%GC3%)含量測(cè)定（五）測(cè)定工程的選定原那么1首選君藥及貴重藥、劇毒藥建立含量測(cè)定方法2其次考慮臣藥及其他味藥3有效成清楚確的，可選有效成分4成分類別清楚的，可測(cè)某一類總成分的含量5檢測(cè)成分應(yīng)歸屬某單一藥味6檢測(cè)成分應(yīng)與中醫(yī)用藥的功能主治相近7確無(wú)法含量測(cè)定的，可測(cè)定浸出物含量化學(xué)分析法色譜法常用定量方法分光光度法1、化學(xué)分析法重量分析法容量分析法特點(diǎn)A、準(zhǔn)確度、精密度高B、抗干擾能力差例2、分光光度法UV法比色法特點(diǎn)A、靈敏度高B、簡(jiǎn)便、快速C、精密度稍低D、干擾多蘆丁黃芩苷小檗堿丹皮酚3、TLCS法測(cè)定薄層板上斑點(diǎn)對(duì)單色光的吸收或反射的強(qiáng)度而進(jìn)行定量的方法特點(diǎn)A、別離效果好B、適用于無(wú)法用UV、HPLC法測(cè)定的組分C、準(zhǔn)確度、精密度低于HPLC2000年版中國(guó)藥典〔2000年版〕

薄層掃描法品種品種數(shù)量TLCS數(shù)量占總數(shù)%534〔藥材〕203.74458〔成藥〕326.99978〔總數(shù)〕5210.73（1）、選擇測(cè)定條件1〕薄層色譜條件別離好不拖尾2〕檢測(cè)方法吸收測(cè)定法熒光測(cè)定法反射法透射法3〕掃描方式單波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)線性掃描法鋸齒掃描法外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法4〕散射參數(shù)SX薄層板的散射使Kubelka-Munk方程〔1〕薄層板均勻、平整（2）注意事項(xiàng)〔2〕點(diǎn)樣量準(zhǔn)確〔4〕顯色劑均勻、適當(dāng)〔5〕保護(hù)斑點(diǎn)用相同大小潔凈玻璃蓋住薄層板，并用透明膠紙封住邊緣，以起固定和隔絕空氣作用〔3〕斑點(diǎn)應(yīng)完全別離，不拖尾

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樣樣對(duì)對(duì)樣樣對(duì)對(duì)樣樣對(duì)對(duì)

低高

低高

低高

外標(biāo)法〔兩點(diǎn)校正法〕4、HPLC法RP-HPLC色譜柱ODS流動(dòng)相甲醇-水PIC反離子氫氧化四丁基銨色譜柱ODSRP-PIC反離子烷基磺酸鹽無(wú)機(jī)陰離子外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法離子對(duì)色譜法〔PIC〕極性流動(dòng)相中參加離子對(duì)試劑，與被分析離子生成中性離子對(duì)，從而增加在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增大2000年版中國(guó)藥典〔2000年版〕

HPLC法品種品種數(shù)量HPLC數(shù)量占總數(shù)%534〔藥材〕5410.11458〔成藥〕4810.48978〔總數(shù)〕10220.59中藥制劑分析的進(jìn)展〔一〕新方法的研究進(jìn)展1、計(jì)算藥物分光光度法2、模式識(shí)別法〔二〕新技術(shù)的研究進(jìn)展1、多維色譜及連用技術(shù)2、藥理、生物測(cè)定技術(shù)〔三〕微量元素分析的研究進(jìn)展應(yīng)用實(shí)例-小青龍合劑[處方]麻黃125g桂枝125g白芍125g干姜125五味子125g細(xì)辛62g甘草(蜜炙)法半夏188gNOTES：合劑是在傳統(tǒng)湯劑根底上改進(jìn)后的一種新劑型生物堿桂皮醛芍藥甙揮發(fā)油三萜皂甙應(yīng)用實(shí)例-小青龍合劑[制法]以上八味，細(xì)辛、桂枝提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器收集，藥渣與白芍、麻黃、五味子、甘草加水煎煮至味盡，合并煎液，濾過(guò)，濾液和蒸餾后的水溶液合并，濃縮至約1000ml。法半夏、甘姜照流浸膏劑項(xiàng)下滲漉法，用70%乙醇作溶劑，浸漬24小時(shí)后進(jìn)行滲漉，漉液濃縮，與上述藥液合并，靜置，濾過(guò)，濾液濃縮至1000ml，參加苯甲酸鈉3g與細(xì)辛、桂枝揮發(fā)油，攪勻，即得。[性狀]本品為棕黑色的液體；氣微香，味甜、微辛。[功能與主治]解表化飲，止咳平喘。用于風(fēng)寒水飲，惡寒發(fā)熱，無(wú)汗，喘咳痰稀。[用法與用量]口服，一次10-20ml，一日3次，用時(shí)搖勻。方藥分析：君麻黃—發(fā)汗為君臣桂枝—解表為臣佐甘草—恐發(fā)汗太過(guò),佐以甘草緩之使白芍、干姜、細(xì)辛、法半夏、五味子—幾藥合力共為使。可外發(fā)汗，內(nèi)行水，散表里之邪。漢代張仲景《傷寒論》——小青龍湯近代由重慶桐君閣中藥廠該湯劑為合劑本方治療傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳。近代也用于慢性支氣管炎，支氣管哮喘、肺氣腫，均見(jiàn)咳、喘、痰白清稀者。供試品溶液與陰性對(duì)照液的制備：取合劑10ml，石油醚分3次萃取，合并石油醚萃取液[油層]，濃縮至1ml，為供試品溶液A；[水層]用Na2CO3調(diào)PH11-12，用氯仿萃取，合并氯仿萃取液，回收氯仿至干，殘?jiān)?ml甲醇溶解，為供試品溶液B；NOTES：陰性對(duì)照液如上法同步進(jìn)行。1.桂皮醛的鑒別取供試品液A、陰性對(duì)照液、桂皮醛對(duì)照液〔1ug/ml〕15ul，點(diǎn)于同一硅膠G板上，環(huán)己烷-乙酸乙酯〔17：3〕展開(kāi)，晾干，噴2，4—二硝基苯肼乙醇T.S，供試品A與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同的橙色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無(wú)此斑點(diǎn)。2.細(xì)辛揮發(fā)油的鑒別取供試品液A、陰性對(duì)照液、細(xì)辛揮發(fā)油對(duì)照液〔1：10乙醚液〕5ul，點(diǎn)于同一硅膠G板上，環(huán)己烷展開(kāi)，晾干，噴10%香草醛濃硫酸T.S，加熱至顯色，供試品A與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同的粉紅色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無(wú)此斑點(diǎn)。3.麻黃堿的鑒別取供試品液B，陰性對(duì)照液，麻黃堿對(duì)照品液〔1mg/ml〕各5ul，點(diǎn)于同一硅膠G，氯仿-甲醇-濃氨水〔20：5：0.5〕展開(kāi)，晾干，噴茚三酮T.S，加熱至斑點(diǎn)顯色，供試品B與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無(wú)此斑點(diǎn)。取合劑5ml，上聚酰胺柱，DW洗脫，洗脫液水浴濃縮至干，用1ml甲醇溶解，為供試品溶液C；聚酰胺柱再用95%乙醇洗脫，棄取洗脫液，用3M氨乙醇液洗脫，收集洗脫液水浴蒸干，1ml甲醇溶解，為供試品溶液D。4.芍藥甙的鑒別取供試品液C、陰性對(duì)照液、芍藥甙對(duì)照液〔1mg/ml〕10ul，點(diǎn)于同一硅膠G板上，氯仿-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-甲酸〔8：1：2：0.04〕展開(kāi)，晾干，噴10%硫酸乙醇液，加熱至顯色，供試品C與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同的紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無(wú)此斑點(diǎn)。5.甘草酸的鑒別取供試品液D、陰性對(duì)照液、甘草酸銨對(duì)照液〔2mg/ml〕2ul，點(diǎn)于同一硅膠G板上，乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-蒸餾水〔30：2：2：4〕展開(kāi)，晾干，噴10%硫酸乙醇液，加熱至顯色，UV燈365nm觀察，供試品D與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同的紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無(wú)此斑點(diǎn)。含量測(cè)定HPLC法測(cè)定芍藥甙的含量?jī)x器與色譜條件BECKMAN332型高效液相色譜儀163型可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)儀，220nm427型記錄及數(shù)據(jù)處理儀色譜柱為YWGC18流動(dòng)相乙腈-水〔15：85〕標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取芍藥甙5.08mg，溶于水至50ml量瓶中，定容，分別吸取0.50、1.00、1.50、2.00ml于10ml量瓶中定容?；厥章蕼y(cè)定精密吸取除去白芍制成的合劑〔即陰性對(duì)照液〕0.3ml與適量芍藥甙對(duì)照品液，通過(guò)0.5g聚酰胺柱，用水洗脫至50ml量瓶中至刻度，依前述條件測(cè)定，平均回收率為99.42%，RSD為0.23%〔n=3〕。樣品測(cè)定取自制小青龍合劑搖勻，用濾紙過(guò)濾，精密吸取0.3ml濾液通過(guò)聚酰胺柱，以不同回收率測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定。分析實(shí)例—萬(wàn)氏牛黃清心丸[處方]牛黃10g朱砂60g黃連200g黃芩120g梔子120g郁金80g分析實(shí)例—萬(wàn)氏牛黃清心丸[制法]以上六味，除牛黃外，朱砂水飛或粉碎成極細(xì)粉；其余黃連等四味粉碎成細(xì)粉；將牛黃研細(xì)，與上述粉末配研，過(guò)篩，混勻。每100g粉末加煉蜜100-200g制成大蜜丸，即得。古方為糊丸，亦有水丸[性狀]本品為紅棕色至棕褐色的大蜜丸；氣特異，味甜、微澀、苦。[功能主治]清熱解毒，鎮(zhèn)驚安神。用于熱邪內(nèi)閉，煩躁不安，神昏譫語(yǔ)，小兒高熱驚厥。[方藥分析]本方來(lái)源于明.?痘疹世醫(yī)》心法，本方為清心開(kāi)竅劑，主治熱邪內(nèi)陷心包所致竅閉神昏癥。方中牛黃，清心解毒，豁痰開(kāi)竅為君藥；黃連、黃芩、梔子清熱瀉火，為臣藥；朱砂清心，重鎮(zhèn)安神，郁金行氣開(kāi)竅共為佐使藥，合用以奏透邪瀉熱，開(kāi)竅安神之效。[方藥分析]牛黃—清熱解毒藥，主含膽酸類成分。黃連—清熱燥濕藥，主要為小檗堿。黃芩—清熱燥濕藥，主要為黃酮類。梔子—清熱瀉火藥，主含梔子甙。朱砂—安神藥，主含硫化汞〔HgS〕。郁金—活血去瘀藥，主含揮發(fā)油。鑒別顯微鑒別郁金—糊化淀粉團(tuán)塊幾乎無(wú)色。梔子—種皮石細(xì)胞。黃芩—纖維淡黃色，梭形，厚壁，孔溝細(xì)。黃連—纖維鮮黃色，壁稍厚，紋孔明顯。朱砂—不規(guī)那么塊狀物或顆粒狀物，暗紅棕色、鮮紅色或棕黃色。郁金—糊化淀粉團(tuán)塊梔子—種皮石細(xì)胞黃芩—纖維黃連—纖維朱砂—不規(guī)那么塊狀物或顆粒狀物，暗紅棕色、鮮紅色或棕黃色化學(xué)鑒別1.朱砂的鑒別取本品3g，加水適量，研勻，反復(fù)洗去懸浮物，可得少量朱紅色沉淀，取出，參加鹽酸1ml及銅片少量，加熱煮沸，銅片由黃色變?yōu)殂y白色。HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg+H2SNOTES：在酸性條件下，朱砂與銅片發(fā)生置換反響析出金屬汞，在銅片外表形成銀白色汞齊。2.人工牛黃的鑒別取本品，剪碎，加硅藻土0.6g，研勻，加氯仿10ml、冰醋酸0.5ml，加熱回流30min,放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。膽酸和豬去氧膽酸加乙醇制成1ml含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。TLC法CMC-Na，硅膠G展開(kāi)劑醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇〔32:6:1:1〕顯色劑10%磷鉬酸乙醇液，1100C,10min人工牛黃供試品牛黃空白豬去氧膽酸膽酸3.黃芩的鑒別供試品溶液的制備：取本品3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研勻，加甲醇20ml，加熱回流1hr,放冷，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備：黃芩甙對(duì)照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。TLC法CMC-Na，硅膠G〔4%醋酸鈉〕展開(kāi)劑醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水〔5:3:1:1〕顯色劑2%三氯化鐵乙醇液使斑點(diǎn)更為集中-OH與Fe+3絡(luò)合黃芩甙供試品黃芩空白4.梔子的鑒別供試品溶液的制備：取本品3g，加乙醚15ml，研磨，棄去乙醚。殘?jiān)鼡]干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加熱回流1hr,放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備：梔子甙對(duì)照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。TLC法CMC-Na，硅膠G展開(kāi)劑醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水〔10:7:2:0.5〕顯色劑10%硫酸乙醇1050C,10min梔子甙供試品梔子空白5.黃連的鑒別供試品溶液的制備：取含量測(cè)定項(xiàng)下剩余的鹽酸-甲醇提取液4ml，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，使?ml作為供試品溶液。對(duì)照藥材溶液的制備：黃連對(duì)照藥材50mg，加甲醇10ml，回流加熱15min,濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。對(duì)照品溶液的制備：再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。TLC法硅膠GCMC-Na展開(kāi)劑苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液〔12:6:3:3:1〕顯色劑UV〔365nm〕鹽酸小檗堿黃連公式品供試品黃連空白含量測(cè)定1.朱砂取本品約5g，剪碎，精密稱定，置250ml凱氏燒瓶中，加硫酸30ml與硝酸鉀8g，加熱俟溶液至近無(wú)色，放冷，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶中，用水50ml分次洗滌燒瓶，洗液并人溶液中，滴加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，兩分鐘內(nèi)不消失，再滴加2%硫酸亞鐵溶液至紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液滴定，即得。每1ml的硫氰酸銨滴定液相當(dāng)于11.63mg的硫化汞。硫酸與硝酸鉀—分解試樣及有機(jī)破壞高錳酸鉀溶液—除去試樣分解時(shí)產(chǎn)生的亞硫酸粉紅色兩分鐘內(nèi)不消失—亞硫酸可將Hg2+復(fù)原Hg+使含量變低，觀察兩分鐘完全除去亞硫酸硫酸亞鐵溶液—除去過(guò)量的高錳酸鉀滴定反響Hg2++2CNS-→Hg(CNS)2顯色反響CNS-(過(guò)量)+Fe3+→Fe(CNS)2+(紅色)2.黃連取本品約4g，剪碎，精密稱定，置索氏提取器，鹽酸-甲醇〔1:100〕適量，加熱回流提取至提取液無(wú)色，提取液移至50ml量瓶中，用鹽酸-甲醇適量稀釋至刻度，搖勻，照柱色譜法，精密量取5ml，上AL2O3柱,25ml洗脫，收集洗液置50ml量瓶中，乙醇稀釋至刻度，精密吸取2ml置50ml量瓶中，加0.05mol/L硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻。UV345nm測(cè)定A。為728,本品含總生物堿按鹽酸小檗堿計(jì)不得少于1.7%。黃連方中臣藥之首用量最大有效成分清楚黃連有效成分為小檗堿，尚含其它少量生物堿，如黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿、巴馬亭等，均為原小檗堿型生物堿。硫酸溶液—在酸性條件下，N原子呈共軛體系的季銨狀態(tài)，在345nm處有最大吸收。其它五味藥的空白提取液在該波長(zhǎng)處略有吸收，約相當(dāng)于0.3%小檗堿，因此測(cè)定結(jié)果偏高。本品為蜜丸制劑，其黃連生物堿溶出速率較藥材相對(duì)緩慢，回流至提取液無(wú)色后應(yīng)放置一段時(shí)間。第二節(jié)生化藥物分析簡(jiǎn)介一、定義生化藥物指運(yùn)用生物化學(xué)的理論、方法和技術(shù)，從動(dòng)物、植物及微生物等生物體中提取別離的天然活性物質(zhì)，以及這些物質(zhì)及其衍生物的化學(xué)合成、半合成和現(xiàn)代生物技術(shù)制得的產(chǎn)品。一、生化藥物分析的特點(diǎn)〔一〕分子量的不確定性生化藥物除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物外，大局部為大分子的物質(zhì)〔如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等〕，其分子量一般幾千至幾十萬(wàn)。對(duì)大分子的生化藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。甚至化學(xué)結(jié)構(gòu)也不確定，因此要進(jìn)行純度測(cè)定及分子量測(cè)定?！捕撤治龉こ痰奶厥庑?、分析方法：生物檢定法檢定活性2、平安性檢查：熱源檢查、異常毒性試驗(yàn)等3、效價(jià)測(cè)定：酶類藥物〔三〕分析方法多樣性理化測(cè)定法、生化測(cè)定法、生物檢定法二、生化藥物的分析方法〔一〕鑒別１、化學(xué)反響法利用藥物與某試劑在一定條件下反響，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶菌酶分子中的四個(gè)肽鍵上的氮原子能與銅離子〔Cu2＋〕絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、專一催化活性的特殊蛋白質(zhì)，易受酸、堿、重金屬或有機(jī)溶劑等的作用，破壞蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)變性，生成不溶性的沉淀。２、紫外分光光度法三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液〔20μg／ml〕，在〔257±1〕nm的波長(zhǎng)處有最大吸收。A250nm／A260nm的值應(yīng)為0.17～0.27。３、酶法尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。4、電泳法例：肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場(chǎng)作用下，向正極方向移動(dòng)，與肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置應(yīng)相應(yīng)，5、生物法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)鑒別藥物

〔二〕雜質(zhì)檢查生化藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有時(shí)成分并非單一，純化工藝較難，因此，生化藥物的雜質(zhì)檢查就顯得非常重要。1、一般雜質(zhì)檢查生化藥物的一般雜質(zhì)檢查工程包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及枯燥失重、熾灼殘?jiān)?。其檢查的原理及方法與化學(xué)藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同，2、特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。例如，胰蛋白酶是從動(dòng)物膜中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過(guò)程中．易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，中國(guó)藥典〔1995年版〕和USP〔23〕均規(guī)定要檢查此酶，根據(jù)胰蛋白酶的特性選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個(gè)胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個(gè)單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，那么糜蛋白酶的限度為5％〔g／g〕。〔三〕平安性檢查1、熱源檢查：內(nèi)毒素，家兔法〔家兔法〕本法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，以其體溫升高的程度，判定該供試品中所含熱原是否符合規(guī)定，是一種限度試驗(yàn)法。2、異常毒性試驗(yàn)：急性毒性反響的限度試驗(yàn)是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反響。反響的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。中國(guó)藥典規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是一個(gè)限度試驗(yàn)。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗(yàn)動(dòng)物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物急性中毒而死亡，那么反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過(guò)了正常水平，因此，本試驗(yàn)又稱異常毒性檢查法。異常毒性試驗(yàn)的動(dòng)物為小白鼠。試驗(yàn)操作方法有尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服給藥法等。檢查生產(chǎn)過(guò)程是否引入引發(fā)異常毒性的雜質(zhì)3、過(guò)敏試驗(yàn)：檢查異性蛋白藥物中假設(shè)夾雜有異性蛋白，在臨床使用時(shí)易引起病人多種過(guò)敏反響，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結(jié)、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。因此，有可能存在異性蛋白的藥物、應(yīng)作過(guò)敏試驗(yàn)。例如，細(xì)胞色素C是蛋白制劑，在制備中可能摻入少量雜蛋白，為保證使用平安，中國(guó)藥典規(guī)定細(xì)胞色素C溶液及細(xì)胞色素C注射液應(yīng)做過(guò)敏試驗(yàn)。4、降壓物質(zhì)檢查：降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。在用動(dòng)物臟器或組織為原料制備生化藥物的過(guò)程中，正常組織內(nèi)存在的組胺及局部氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等膠類物質(zhì)，均為這類雜質(zhì)的來(lái)源。采用貓〔狗〕血壓法5、無(wú)菌檢查是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查工程之一。根本步驟：①培養(yǎng)基的制備，②選擇對(duì)照用菌液，供對(duì)照試驗(yàn)用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽(yáng)性的結(jié)論?！菜摹澈俊残r(jià)〕測(cè)定生化藥物的含量表示方法通常有兩種：一種用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另一種用生物效價(jià)或酶活力單位表示，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物1、酶法：酶活力測(cè)定法酶分析法〔1〕酶活力測(cè)定法所謂酶活力，是指酶催化一定化學(xué)反響的能力。酶活力的測(cè)定實(shí)際上是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反響的速度。酶反響的速度可以用單位時(shí)間反響底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，酶反響的速度愈快所表示的酶活力愈高。測(cè)定酶活力，可用物理法，化學(xué)法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一：終點(diǎn)法：在適當(dāng)?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測(cè)定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間。第二：將酶和底物混合后隔一定時(shí)間，間斷地或連續(xù)地測(cè)定反響的連續(xù)變化，如吸收度的增加或減少。第三：將酶與底物混合后，讓其反響一定時(shí)間，然后停止反響，定量測(cè)定底物減少或產(chǎn)物生成的量。后兩種方法稱為動(dòng)力學(xué)法或反響速率法：按取樣及檢測(cè)的方式可稱為取樣測(cè)定法或連續(xù)測(cè)定法。酶促反響的條件1〕底物：一般選用底物的濃度［S］＝lookm，因?yàn)樵谶@種情況下反響速度可達(dá)最大速度的99％。大多數(shù)酶具有相對(duì)的專一性，在可被它作用的各種底物中一般選擇Km小的作測(cè)定的底物。2〕pH：氫離子濃度能對(duì)酶反響產(chǎn)生多種影響：它可能改變酶的活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性；也可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致酶失效；還可能作用反響系統(tǒng)的其它組成成分影響酶反響，甚至改變可逆反響進(jìn)行的方向。選擇適宜的反響pH，并將反響維持在這一pH值，酶反響通常借助緩沖系統(tǒng)來(lái)控制pH。3〕溫度：酶反響對(duì)溫度十分敏感，因?yàn)闇囟饶苤苯佑绊懟瘜W(xué)反響速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機(jī)制。一般而言，溫度變化1℃，酶反響速度可能相差5％左右。因此，實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在土0．1℃以內(nèi)。酶反響的溫度通常選用25℃、30℃或37℃。4〕輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些酶那么需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)5〕空白和對(duì)照：每個(gè)酶反響通常都應(yīng)該有適當(dāng)?shù)目瞻缀蛯?duì)照?？瞻资侵鸽s質(zhì)反響和自發(fā)反響引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼赏ㄟ^(guò)不加酶，或不加底物，或二者都加〔但酶需預(yù)先經(jīng)過(guò)失效處理〕。對(duì)照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測(cè)得的結(jié)果，主要作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定方法1〕、終點(diǎn)法：2〕、取樣測(cè)定法：在酶反響開(kāi)始后不同的時(shí)間，從反響系統(tǒng)中取出一定量的反響液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞错懞?，再根?jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差異，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反響變化量的方法。停止酶反響通常采用添加酶的變性劑的方法，如加5％的三氯醋酸、3％的高氯酸或其它酸、堿、醇類。常用的檢測(cè)方法有可見(jiàn)．紫外分光光度法、熒光分析法等。3〕、連續(xù)測(cè)定法連續(xù)測(cè)定法那么是基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反響過(guò)程中對(duì)反響系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)的方法。，顯然從準(zhǔn)確性和測(cè)定效率看連續(xù)法都比較好。a〕紫外-可見(jiàn)分光光度法：這是根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長(zhǎng)或波段上，有明顯的特征吸收差異而建立起來(lái)的連續(xù)檢測(cè)方法。b〕熒光分析法：它的原理是，如果酶反響的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反響速度。c〕旋光度法：某些酶反響過(guò)程常伴隨著旋光變化，在沒(méi)有其它更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度測(cè)定法。d〕酶偶聯(lián)測(cè)定法：所謂酶偶聯(lián)法是應(yīng)用過(guò)量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶〞，使被測(cè)酶反響能繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。以和光學(xué)檢測(cè)法相偶聯(lián)的分析法為例：e〕其他：其他檢測(cè)法有電化學(xué)測(cè)定法；離子選擇性電極測(cè)定法適用于產(chǎn)酸反響中pH變化的測(cè)定；放射化學(xué)法的特點(diǎn)是靈敏度極高，可直接用于酶活性測(cè)定，缺點(diǎn)是操作繁而費(fèi)時(shí)。〔2〕酶分析法酶分析法是一種以酶為分析工具〔或試劑〕的分析方法。分析的對(duì)象可以是酶的底物、輔酶活化劑甚至酶的抑制劑1)．動(dòng)力學(xué)分析法:這種分析法的原理是：通過(guò)條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反響中起決定反響速度的主導(dǎo)作用，這時(shí)酶反響速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，這樣測(cè)定酶反響的速度就可求出它們的濃度2)．總變量分析法:又稱為平衡法或終點(diǎn)法。根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，然后在反響完成后，借助物理化學(xué)方法測(cè)出其總變化量，并參考反響的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測(cè)物的實(shí)際含量或濃度的一種分析方法。僅適用于底物物質(zhì)的測(cè)定，應(yīng)用時(shí)應(yīng)考慮工具酶的用量與反響的平衡點(diǎn)。2、電泳法電泳法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)范圍廣、操作簡(jiǎn)便并兼?zhèn)鋭e離、鑒定、分析等優(yōu)點(diǎn)，故已成為生物技術(shù)及生化藥物分析的重要手段之一。(1〕電泳法的根本原理和分類原理：在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。電泳別離是基于溶質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移速度不同而進(jìn)行的。l〕自由界面電泳：在二根U形管里的溶液中，同種分子的構(gòu)型及荷電情況根本一致，在電場(chǎng)影響下，它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面。2〕區(qū)帶電泳：在電泳過(guò)程中，應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)，在電場(chǎng)作用下，使具有不同泳動(dòng)速度的組分形成各自區(qū)帶的電泳。根據(jù)所用的支持物不同可分為：紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和十二烷基硫酸納〔SDS〕聚丙烯酰胺凝膠電泳法。3〕高效毛細(xì)管電泳：是在一根內(nèi)徑約50μm的毛細(xì)管中，在高壓電場(chǎng)下進(jìn)行樣品別離分析的一種新型電泳技術(shù)。〔2〕常用電泳法的類型及其應(yīng)用1〕．紙電泳法：是用濾紙作為支持介質(zhì)的一種電泳法，其操作要點(diǎn)如下A〕緩沖液的選擇：應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性，需要的電泳速度和分辨力，選擇適宜的緩沖液、pH值和離子強(qiáng)度。B〕濾紙的裁剪：濾紙可按需要裁成與電泳槽相當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)方形或長(zhǎng)條形，樣點(diǎn)的間距為2～3cm，濾紙長(zhǎng)度視電源輸出最高