分離工程第三章課件

第三章沉淀與泡沫分離1第一節(jié)

沉

淀2什么是沉析？沉析法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)有哪些？沉析的一般操作步驟是什么？何謂鹽析？其原理是什么？鹽析操作時(shí)常用的鹽是什么？影響鹽析的主要因素有哪些？3通過本章學(xué)習(xí)應(yīng)掌握以下內(nèi)容有機(jī)溶劑沉析法的原理是什么？影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素有哪些？等電點(diǎn)沉析的工作原理是什么？其它常用的沉析方法有哪些？4沉淀（Precipitation）：是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低，生成固體凝聚物的現(xiàn)象。結(jié)晶：由溶解度降低引起的固體成相現(xiàn)象。沉淀的純度遠(yuǎn)低于結(jié)晶，是一種初級(jí)分離技術(shù)。但多步沉淀操作也可制備高純度的目標(biāo)產(chǎn)物，相當(dāng)于重結(jié)晶，沉淀分級(jí)目前主要用于蛋白質(zhì)的分離。5常用沉淀方法的分類6一、鹽 析

沉

淀7（一）、原理8鹽析（Salting-out

）：蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度溶液中溶解度降低，發(fā)生沉淀的現(xiàn)象。Cohn經(jīng)驗(yàn)方程：其中：S為蛋白質(zhì)的溶解度；

為常數(shù)；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強(qiáng)度；ci和Zi分別為離子i的摩爾濃度和電荷數(shù)。鹽析的機(jī)理還不十分清楚，但一般認(rèn)為高離子強(qiáng)度使蛋白質(zhì)表面雙電層變薄和水化程度降低。.β和Ks的物理意義9β—鹽濃度為0時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度的對(duì)數(shù)值。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無(wú)關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽的種類有關(guān)，

與溫度、pH值無(wú)關(guān)。Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強(qiáng)度進(jìn)行鹽析的方法；β鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，改變pH和溫度進(jìn)行鹽析；其中，Ks鹽析法由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。而β鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶12鹽析（（NH4）2SO4）蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)13，這些鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下

兩種情況：“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：無(wú)機(jī)離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀；14Electric

double

layer（二）、影響因素161、蛋白質(zhì)的分子量和立體結(jié)構(gòu)分子量越大越易鹽析，結(jié)構(gòu)越不對(duì)稱越易鹽析。2、對(duì)特定的蛋白質(zhì)（1）無(wú)機(jī)鹽種類（影響Ks)離子半徑小而帶電荷較多的陰離子鹽析效果較好。選擇鹽析鹽時(shí)還應(yīng)考慮：a、溶解度大。b、溶解度受溫度影響較??；c、鹽溶液密度不高，利于沉淀的沉降或離心分離。d、常用的鹽析鹽是(NH4)2SO4，此外還有Na2SO4和NaCl。17鹽析用鹽的選擇18在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂(2)溫度和pH值（影響β）19高離子強(qiáng)度下，溫度升高，蛋白質(zhì)溶解度下降,β減小。pH值接近蛋白質(zhì)pI值時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小。20(三)、鹽析操作(以硫酸銨為例)確定沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)所需硫酸銨飽和度的實(shí)驗(yàn)步驟（設(shè)操作溫度為0℃）：取部分料液，分成等體積的幾份，冷卻至0℃；用下式計(jì)算飽和度（濃度相當(dāng)于飽和濃度的百分?jǐn)?shù)）達(dá)到20％~100％所需加入硫酸銨量，并在攪拌條件下分別加到料液中，繼續(xù)攪拌1h以上，同時(shí)保持溫度在0℃；其中：W為硫酸銨加入量（g/L)；S1和S2為飽和度；505為0℃時(shí)硫酸銨飽和濃度（質(zhì)量百分比，g/L）；0.285為0℃時(shí)硫酸銨飽和濃度（體積百分比，L/L）。21–3000g下離心40min，將沉淀溶于2倍體積的緩沖22液中，測(cè)定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度；–分別測(cè)上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白的濃度，比較沉淀前后蛋白質(zhì)是否保持物料守恒；—以上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度對(duì)飽和度作圖，從而可根據(jù)所要求達(dá)到的目標(biāo)蛋白純化倍數(shù)和回收率確定硫酸銨的加入量。(四)、應(yīng)用由于鹽析沉淀后產(chǎn)物中鹽含量較高，故一般在鹽析沉淀后，需進(jìn)行脫鹽處理，才能進(jìn)行后續(xù)的純化操作。23思考題24蛋白質(zhì)鹽析沉淀后除鹽采取什么方法？二、等電點(diǎn)沉淀25等電點(diǎn)(pI)：蛋白質(zhì)靜電荷為零時(shí)的p

H值為其等電點(diǎn).利用蛋白質(zhì)在pH等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下降的原理進(jìn)行沉淀分級(jí)的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法（Isoelectri

precipitation）。操作條件：低離子強(qiáng)度；pH

pI。–低離子強(qiáng)度調(diào)pH值至等電點(diǎn)，或在等電點(diǎn)的pH下利用透析方法降低離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)沉淀。2627適用于疏水性大蛋白質(zhì)（如酪蛋白），對(duì)于親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)（如明膠）則不太適用。特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需后續(xù)的脫鹽操作。缺點(diǎn)：由于操作pH過低，容易引起目標(biāo)蛋白質(zhì)的失活.29三、有機(jī)溶劑沉淀30定義：向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇

等水溶性有機(jī)溶劑，造成蛋白質(zhì)分子表

面水化程度降低，從而發(fā)生沉淀的方法。例：血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍用此法31常用的有機(jī)溶劑沉析劑32乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無(wú)毒常用

于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，因而靜電吸引力增大。33操作條件：低離子強(qiáng)度；等電點(diǎn)附近。加入有機(jī)溶劑充分?jǐn)嚢?，快速，蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸時(shí)間短。特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑密度較低，易于沉淀分離；不需后續(xù)脫鹽處理；缺點(diǎn)：易引起蛋白質(zhì)變性，須在低溫下進(jìn)行。34有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)35分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；–

應(yīng)注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇36介電常數(shù)要小致變性作用要?。状迹┒拘砸?、揮發(fā)性適中水溶性要好影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素37溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（

溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:

0.5~2%?。喝軇┯昧看螅厥章实?，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+本法應(yīng)用，注意下列各點(diǎn)：（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)變性，加有機(jī)溶劑于水常為放熱反應(yīng)，故操作時(shí)需冷卻。例：乙醇沉淀血漿蛋白，在

-10℃

下進(jìn)行。（2）所選溶劑必須能與水互溶，而和蛋白質(zhì)不起作用，常用乙醇、丙酮。38（3）蛋白質(zhì)分子量越大，產(chǎn)生沉淀需加入的有機(jī)溶劑量越少。如用丙酮作沉淀劑有下列關(guān)系式：[所需丙酮量]=1.8-0.12[蛋白質(zhì)分子量]（4）一種蛋白質(zhì)溶解度會(huì)由于另一種蛋白質(zhì)存在而降低。（5）沉淀的蛋白質(zhì)如不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。39（6）接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑量少。（7）少量中性鹽（0.1~0.2molL-1)的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白質(zhì)所需有機(jī)溶劑量增大，一般I=0.05

或稍低為最好，既能使沉淀迅速形成，又能對(duì)蛋白質(zhì)起保護(hù)作用。40（8）鹽析法制蛋白質(zhì)透析除鹽，進(jìn)一步純化可用有機(jī)溶劑沉淀。41四、熱沉淀（Thermal

precipitation)42定義：利用在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀的現(xiàn)象，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)蛋白的方法。熱沉淀基于蛋白質(zhì)的變性動(dòng)力學(xué)。假設(shè)變性過程符合一級(jí)反應(yīng)規(guī)律：43操作條件：調(diào)節(jié)pH；加入有機(jī)溶劑。特點(diǎn)：是一種變性分離法，帶有冒險(xiǎn)性，需對(duì)目標(biāo)蛋白和共存雜蛋白的熱穩(wěn)定性有充分了解。44五、其他沉淀法45（一）、非離子型聚合物沉淀法46

機(jī)理不清，可能是降低蛋白質(zhì)分子表面的水化程度或空間排阻作用。常用聚合物：聚乙二醇（PEG）。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因?yàn)闊o(wú)毒、不可燃燒且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。–PEG沉淀分離蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：1、體系溫度只須控制在室溫下。482、沉淀的顆粒較大，產(chǎn)物易收集。3、PEG不會(huì)使蛋白變性。PEG沉淀分離蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)：PEG很難從蛋白質(zhì)溶液中除去，須用超濾和液-液萃取解決。PEG分子量需大于4000，最常用6000和20000。所用PEG濃度通常為20%，濃度再高會(huì)使黏度增大，造成沉淀回收困難，若

PEG對(duì)后繼分離步驟影響較小，可以不必除去。蛋白質(zhì)溶解度與PEG濃度之間的關(guān)系：lgS=lgS0

-k[PEG]S:PEG存在時(shí)濃度，S0:無(wú)PEG時(shí)濃度，k:常數(shù)，與蛋白質(zhì)和PEG分子大小有關(guān)。49（二）、聚電解質(zhì)沉淀法50沉淀機(jī)理：與絮凝類似，在蛋白質(zhì)之

間起架橋作用，同時(shí)還兼有鹽析作用。應(yīng)用：主要用于酶和食品蛋白的回收常用的聚電解質(zhì)：酸性多糖、海藻酸鹽、果膠酸鹽、卡拉膠和羧甲基纖維素等。聚電解質(zhì)是長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，鏈上有許多活性51官能團(tuán)，如：-COOH、NH

+等離子型基4團(tuán)，通過靜電引力、范德華力、氫鍵強(qiáng)烈吸附膠體表面，產(chǎn)生架橋作用。鏈越長(zhǎng)，活性基團(tuán)越多，效果越好。（三）、金屬離子沉淀法52沉淀機(jī)理：可與蛋白質(zhì)分子上的某些殘基發(fā)生作用而使蛋白質(zhì)沉淀。如Ca2+和Mg2+能與羧基結(jié)合，Mn2+和Zn2+能與羧基、含氮化合物以及雜環(huán)化合物結(jié)合。–優(yōu)點(diǎn)：可使?jié)舛群艿偷牡鞍踪|(zhì)沉淀；沉淀后金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。53第二節(jié) 泡

沫

分

離54自學(xué)思考題551、名詞解釋：鹽析和鹽溶、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)變性。2、扼要解釋為什么大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在溶液中具有下列性質(zhì)？（1）在低pH值時(shí)沉淀。（2）當(dāng)離子強(qiáng)度從零逐漸增加時(shí)，其溶解度開始增