第二十六章 基因工程藥物

第二十六章基因工程藥物編輯課件基因工程藥物概論基因工程藥物含義基因工程藥物是指采用基因工程技術(shù)研制的，能預防和治療某種疾病但含量極微而難以用傳統(tǒng)方法制取的特殊藥物。編輯課件一、基因工程藥物種類蛋白細胞因子藥物蛋白類激素溶血栓藥物治療用酶可溶性受體和黏附分子其它核酸DNA藥物反義RNA藥物RNAi藥物核酶編輯課件重組蛋白質(zhì)類藥物細胞因子藥物：干擾素、集落因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、生長因子、凝血因子蛋白質(zhì)類激素藥物：生長激素、胰島素、胰島素樣生長因子、促卵泡素、甲狀旁腺素、降鈣素、胰高血糖素、促黃體生成素、甲狀腺刺激素和心鈉素等。溶血栓藥物：組織型纖溶酶激活劑、尿激酶型纖溶原激活物、蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑、鏈激酶和葡激酶等。治療用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受體和黏附分子：可溶性補體受體Ⅰ型其他：血紅蛋白、白蛋白等。編輯課件核酸類藥物核酸類藥物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上發(fā)揮作用，它通過糾正突變的基因并使之重新獲得適當?shù)墓δ軄碇委熁蝾A防疾病。特點是：能將基因表達的產(chǎn)物的作用局限于病變組織周圍，從而使治療更具針對性；只要轉(zhuǎn)化細胞不被去除，轉(zhuǎn)化的式因不被抑制，基因表達的產(chǎn)物就可以持續(xù)發(fā)揮作用。編輯課件基因工程藥物的特點從根本上解決了某些藥物的生物原料適應證不斷延伸技術(shù)含量高加速疑難病癥新藥物的開發(fā)編輯課件二、研制基因工程藥物的關(guān)鍵技術(shù)確定研制基因工程藥物的技術(shù)路線根本技術(shù)路線1：獲得具有預防和治療作用的蛋白質(zhì)的基因組入表達載體受體細胞高效表達動物試驗臨床試驗申報新藥證書根本技術(shù)路線2：基因組未知功能的人類基因全長cDNA群組入表達載體受體細胞瞬間表達功能初篩功能驗證重組蛋白表達體內(nèi)外藥效分析臨床前研究臨床驗證申報新藥證書優(yōu)點：目的明確。缺點：發(fā)現(xiàn)新藥的機率低，在人體內(nèi)表達量較高的蛋白質(zhì)才有較大可能被開發(fā)。建立在龐大人類基因資源根底上的，具有巨大的開發(fā)潛力，縮短新藥開發(fā)的時間，可大規(guī)模增加新藥的數(shù)量。編輯課件

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線編輯課件基因工程的操作流程1、分：別離目的基因2、切：對目的基因和載體適當切割3、接：目的基因與載體連接4、轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞5、篩：篩選出含有重組體的受體細胞6、表：目的基因在受體細胞中表達，受體細胞成長為基因改造生物編輯課件基因工程制藥的根本過程獲得目的基因

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構(gòu)建重組質(zhì)粒

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組建基因工程細胞

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工程菌培養(yǎng)

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產(chǎn)物別離純化編輯課件編輯課件三、基因工程制藥實例12編輯課件人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子〔granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF〕是一個具有多項潛能的造血生長因子，它不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，而且對其它的細胞，如抗原遞呈細胞、成纖維細胞、角質(zhì)細胞、皮膚粘膜細胞等，均有著不同程度的刺激作用。GMCSF對某些疾病，如腫瘤患者放療、化療以后的白細胞減少癥、再生障礙性貧血和骨髓移植的治療有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治療中也有良好的療效。編輯課件1985年Sieff等發(fā)表了第一篇有關(guān)重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的文章后，這些年來有關(guān)rhGMCSF研究報道的文獻每年均在千篇左右。GMCSF是糖蛋白，相對分子質(zhì)量為22000，基因定位在第5條染色體長臂上，基因約2.5kb，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。其mRNA包括編碼成熟蛋白質(zhì)的127個氨基酸殘基和信號肽的17個氨基酸殘基的密碼子。編輯課件重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子產(chǎn)品編輯課件1.人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的制備利用表達分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表達具有天然結(jié)構(gòu)和生物活性的GMCSF，表達量高，易于純化，無需復性，純化的GMCSF比活高于包含體型，但其發(fā)酵表達技術(shù)較難掌握。編輯課件分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF發(fā)酵工藝發(fā)酵甘油保存菌劃平皿，挑取單菌落，接種于LB種子培養(yǎng)基中，18h，再擴大培養(yǎng)12h，接種于30L發(fā)酵罐，30℃培養(yǎng)，過程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培養(yǎng)20h左右時開始表達，28h表達是頂峰，之后細菌開始死亡，雜蛋白增加。培養(yǎng)過程中，尤其是對數(shù)期，用葡萄糖的加量來控制細菌生長速度，以免溶氧量下降過快。發(fā)酵產(chǎn)物為分泌型GMCSF，占菌體總蛋白的25%以上。編輯課件發(fā)酵產(chǎn)物收集、純化離心離子交換層析或親和層析純化超濾濃縮，分子篩除菌過濾、分裝、凍干編輯課件近年應用較多的還有融合蛋白表達GMCSF的方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′換用ＴＡＡ終止密碼，將其克隆入多種不同表達融合蛋白的載體中，并在ｃＤＮＡ與上游細菌蛋白基因之間嵌入凝血酶接頭，導入適當宿主后均獲得高效表達，表達融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后釋放出Ｎ－末端與天然成熟蛋白一級結(jié)構(gòu)〔糖基化除外〕完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，經(jīng)層析純化可得到適宜人體應用的活性蛋白。編輯課件2.質(zhì)量控制標準和要求半成品檢定

主要包括以下工程：蛋白質(zhì)含量測定，活性測定，比活性測定，相對分子質(zhì)量測定，純度測定，核酸含量測定，鼠IgG含量測定，等電點測定，無菌試驗，熱原質(zhì)等。成品檢定

主要包括以下工程：外觀檢查，活性測定，水分測定，無菌試驗，平安毒性試驗，熱原質(zhì)試驗，肽圖測定等。編輯課件二、干擾素干擾素〔interferon，IFN〕是人體細胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成局部。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。α型干擾素再分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區(qū)別表現(xiàn)為個別氨基酸的差異。早期干擾素是用病毒誘導人白血球產(chǎn)生的，產(chǎn)量低、價格昂貴，不能滿足需要。編輯課件1、基因工程菌的組建人染色體上的干擾素基因只有1.5%，拷貝量極少，所以不能直接從人體的染色體上別離干擾素基因。編輯課件組建干擾素工程菌的流程誘生的白細胞提取全RNA通過寡dT-纖維素柱獲得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度離心提取12S的mRNA自mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA雙鏈cDNA用末端DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或dG尾pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火獲得雜交質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12擴增雜交質(zhì)粒篩選抗四環(huán)素但對氨芐青霉素敏感的細菌克隆

用干擾素的DNA片段作為探針挑選富有干擾素cDNA的克隆

將干擾素cDNA克隆入表達載體在大腸桿菌中進行高效表達

編輯課件2.基因工程干擾素的制備制備基因工程α-干擾素工藝流程如下：啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提半成品檢定半成品制備精提

分裝凍干成品檢定成品包裝編輯課件2、基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)人干擾素a-2b的基因工程菌為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

質(zhì)粒使用PL啟動子，含有四環(huán)素抗性基因。

種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl↓

基因工程菌接種到4個1000ml三角燒瓶之中，每個燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)10小時，作為發(fā)酵罐的種子↓

用15L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L

發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下〔1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml四環(huán)素、少量防泡沫劑，PH=6.8?！场?/p>

攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%

30℃發(fā)酵8小時〔細菌增殖階段〕

42℃誘導2-3小時〔產(chǎn)物生產(chǎn)階段〕↓

鑒控手段：每隔不同時間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。編輯課件3、干擾素的制備發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min，除去上清液，得濕菌，從其中取100g。懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液〔PH=7.0〕500ml之中，冰浴條件下進行超聲破碎。

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4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀局部用100ml提取液在室溫條件下，進行攪拌抽提2小時，提取液組成配方[8mol/L尿素、20mmol/L磷酸緩沖液〔PH=7.0〕、0.5mmol/L二巰基蘇糖醇]。

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提取液15000r/min離心30min，下層不溶棄去。取上清液，用20mmol/L磷酸緩沖液〔PH=7.0〕稀釋至尿素濃度0.5mol/L

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參加0.1mmol/L二巰基蘇糖醇，4℃攪拌15小時。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮

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濃縮液采用SephadexG50層析柱別離，層析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸緩沖液〔PH=7.0〕平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫別離

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收集人干擾素a-2b局部，用SDS檢查。再經(jīng)DE-52柱進行純化

層析柱2cm*50cm、上柱之后，分別采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸緩沖液〔PH=7.0〕洗滌。

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收集含有收集人干擾素a-2b局部。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

[得率要求：全過程蛋白質(zhì)回收率為20-25%，產(chǎn)品不含雜蛋白質(zhì)、DNA、熱原質(zhì)檢測合格。]編輯課件4、質(zhì)量控制標準和具體要求〔1〕半成品檢定〔2〕成品檢定編輯課件〔1〕半成品檢定--13項指標1、干擾素效價測定采用細胞病變抑制法，用Wish細胞、VSV病毒作為根本檢測系統(tǒng)，對照國家標準、或者國標參考品。2、蛋白質(zhì)含量測定用福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白質(zhì)作為對照3、比活性測定干擾素效價國際單位÷蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)4、純度測定〔1〕銀染顯色法測定應為單一顯色區(qū)帶，〔2〕掃描儀測定純度應在95%以上，〔3〕SDS電泳測定允許少量聚合體存在，但不超過10%，〔4〕高效液相色譜測定應呈一個吸收峰狀態(tài)，主峰應占峰總面積的95%，〔5〕GPC柱純度測定也應呈一個吸收峰狀態(tài)，主峰應占峰總面積的95%。編輯課件5、相對分子量測定用復原型SDS法，加樣不低于5ug，用分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)標準化系列作對照，遷移率為橫坐標、相對分子質(zhì)量的對數(shù)作為縱坐標，計算相對分子質(zhì)量，其誤差不得高于10%。6、剩余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每一劑量中的剩余外源性DNA應低于100pg。7、剩余抗生素活性測定但凡菌種傳代中使用過抗生素的基因工程產(chǎn)物，必須進行剩余抗生素活性測定，半成品中不得檢出剩余抗生素活性。8、紫外光譜掃描用全自動掃描紫外分光光度計測定光譜圖，其最大吸收值應為280nm∝2nm。9、肽圖測定用CNBr裂解法測定，每一批次之間應該保持一致。10、等電點測定等電點聚焦電泳法，每一批次之間應該保持一致。11、無菌試驗微生物學檢測法。12、熱原質(zhì)試驗鱟試劑法。編輯課件〔2〕成品檢定--7項指標1、物理性狀外觀為折色、微黃色疏松體，參加注射用蒸餾水之后，不得含有肉眼可見的不溶物。2、鑒別試驗〔1〕ELISA試驗、〔2〕中和試驗3、水分測定用卡氏水分測定儀，水分含量應低于3%。4、無菌試驗微生物學檢測法。5、熱原質(zhì)試驗鱟試劑法。6、干擾素效價測定采用細胞病變抑制法，用Wish細胞、VSV病毒作為根本檢測系統(tǒng)，對照國家標準、或者國標參考品。效價不得低于標示量。7、平安試驗實驗動物測定法：

〔1〕取體重350-400g豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射人體臨床允許最大量的3倍劑量，飼養(yǎng)觀察7天，如果豚鼠局部無紅腫、壞死，豚鼠總