DB15-T 3279-2023 苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌鑒定方法

65.020.01CCS

B

0515 DB15/T

3279—2023苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌鑒定方法Identification

of

root

rot2023-12-29

發(fā)布 2024-01-29

實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB15/T

3279—2023 本文件按照GB/T

1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC

19）歸口。鄉(xiāng)村振興研究中心。孫林、劉思博、張英、劉亞東、李國強。DB15/T

3279—20231 范圍判定。本文件適用于苜蓿銳頂鐮刀菌根腐病的室內(nèi)鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。銳頂鐮刀菌根腐病

acuminatum

root

rot由銳頂鐮刀菌（Fusarium

acuminatum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近會出現(xiàn)爛霉變，并發(fā)生壞死，根莖出現(xiàn)中空，側(cè)根出現(xiàn)大量腐爛壞死，分枝減少。4 主要儀器與用具光學(xué)顯微鏡、搖床、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高速冷凍離心機、儀、培養(yǎng)皿、酒精燈、血球計數(shù)板、解剖刀、接種針、移液器、槍頭、離心管。5 主要試劑與材料試劑5.1.1

次氯酸鈉。5.1.2

無水乙醇。5.1.3

硫酸鏈霉素(500

mg/mL)。5.1.4

真菌基因組提取試劑盒。5.1.5

PCR

SuperMix。5.1.6

凝膠電泳試劑：瓊脂糖，，

Buffer，

Marker。培養(yǎng)基5.2.1 水瓊脂培養(yǎng)基（WA:

Water

Agar）：瓊脂粉

g，加蒸餾水定容至

1000

，121

℃高壓濕熱DB15/T

3279—2023滅菌

。5.2.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA:

Potato

Dextrose

Agar

200

g，葡萄糖

g，瓊脂粉

15

g，加蒸餾水定容至

1000

，

℃高壓滅菌

20

min。5.2.3 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB:

Potato

Dextrose

Broth）：馬鈴薯

g，葡萄糖

20

g蒸餾水定容至

1000

mL，

℃高壓滅菌

20

。5.2.4 綠豆瓊脂培養(yǎng)基（MBA:

Mung

Bean

）：綠豆粉

g，瓊脂粉

15

g，加蒸餾水定容至

mL，

20

。6 實驗室檢測病原菌的分離和純化6.1.1 病原菌的分離約0.5

cm×0.5

cm的小組織塊，用酒精和次氯酸鈉分別處理3

min和5

，無菌水清洗5次。把表面消毒的發(fā)病組織放在培養(yǎng)基上25

A中的圖。6.1.2病原菌的純化待PDA培養(yǎng)基長出菌落后取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接3次后再進行單孢分離獲得純化菌株用于后續(xù)試驗，見附錄A中的圖滅菌甘油將分離鑒定后的菌株于-80

℃保存，對不需長期保存的菌株及時滅活處理。感染苜蓿根腐病的樣品保存于4

℃冰箱中，以備復(fù)核。菌落培養(yǎng)特性和病菌形態(tài)特征鑒定6.2.1 銳頂鐮刀菌在

培養(yǎng)基生長形態(tài)銳頂鐮刀菌在PDA平板上菌絲呈粉紅色絨毛狀，生長到后期，顏色逐漸加深變成桃紅色，菌絲有隔且具分支，見附錄A的圖。6.2.2 銳頂鐮刀菌分生孢子0～1

14.0

μm×3.5

μm～4.9

2～518.2

μm×3.9

μm～6.3

μm，見附錄A中的圖A.3。分子鑒定6.3.1 病原菌基因組

的提取病原菌菌株在25

PDA平板上生長5～7

d后，轉(zhuǎn)接至裝有50

mL的培養(yǎng)基靜置生長3

d收集菌絲，液氮下研磨，使用真菌基因組提取試劑盒提取病原菌后進行分子生物學(xué)鑒定。6.3.2 PCR

檢測鑒定6.3.2.1 引物采用區(qū)通用引物和ATATGC-3')和RPB2基因通用引物fRPB2-7Cf(5'-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3')和fRPB2-11aR(5'-G獲得分生孢子，用無菌水配置成濃度為10

個分生孢子懸浮液。DB15/T

獲得分生孢子，用無菌水配置成濃度為10

個分生孢子懸浮液。CRTGGATCTTRTCRTCSACC-3'）以及鐮刀菌序列引物Fusphoo-f(5'-ATGCARGGYATYGGHCARCTHGT-3')和Fusphoo-r(5'-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3')進行PCR擴增。6.3.2.2 PCR

PCRITS、RPB2、PHO序列大小分別為

bp左右和850

bp

bp左右的目的片段，見附錄A中的圖。送至測序公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫比對。6.3.2.3 聚類分析聚類分析結(jié)果表明，以ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的三線鐮刀菌(JX989827.1)、燕麥鐮刀菌（KX058547.1）、銳頂鐮刀菌（MT557673.1）聚為同一類，見附錄A中的圖A.5fRPB2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銳頂鐮刀菌(HM068335.1)聚為同一類，見附錄A中的圖A.6。以序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銳頂鐮刀菌(KJ200247.1)聚于同一類，見附錄AA.7。致病性測定6.4.1分生孢子懸浮液制備選取形態(tài)特征與F.acuminatum形態(tài)特征相符且66.4.2 病原菌回接

d1014

d～20

d接種發(fā)病的苜蓿根部再做病原菌分離、培養(yǎng)，觀察是否與F.

acuminatum進行檢測。7 結(jié)果判定F.

）相符，PCR

擴增鑒定為

F.

acuminatum，且苜蓿致病性測試的分離物，鑒定定為

F.

acuminatum。DB15/T

3279—2023

附錄 A（資料性）苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程見圖~圖A.7。取樣 清洗分離 涂板搖菌 鏡檢 再次分離提取 測序比對圖A.1

苜蓿根腐病病原菌的分離純化A:圖A.2

PDA

培養(yǎng)基銳頂鐮刀菌生長形態(tài)

DB15/T

3279—2023

A:C:圖A.3

銳頂鐮刀菌孢子與菌絲形態(tài)750bp500bp1000b