蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

生物化學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其應(yīng)用.§蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系§蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)§蛋白質(zhì)的別離、純化與測(cè)定.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系⒈一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的根底

RNase是由124氨基酸殘基組成的單肽鏈，分子中8個(gè)Cys的-SH構(gòu)成4對(duì)二硫鍵，形成具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。在蛋白質(zhì)變性劑〔如8mol/L的尿素〕和一些復(fù)原劑〔如巰基乙醇〕存在下，酶分子中的二硫鍵全部被復(fù)原，酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈完全伸展，酶的催化活性完全喪失。當(dāng)用透析的方法除去變性劑和巰基乙醇后，發(fā)現(xiàn)酶大局部活性恢復(fù)，所有的二硫鍵準(zhǔn)確無誤地恢復(fù)原來狀態(tài)。假設(shè)用其他的方法改變分子中二硫鍵的配對(duì)方式，酶完全喪失活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)，而特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)具有生物活性的保證。如以下圖：..2.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此最終決定了蛋白質(zhì)的功能。84個(gè)氨基酸的胰島素原〔proinsulin〕，胰島素原也沒活性，在包裝分泌時(shí)，A、B鏈之間的33個(gè)氨基酸殘基被切除，才形成具有活性的胰島素。如下圖:.豬胰島素原激活成形成胰島素示意圖.胰島素：AB兩條鏈構(gòu)成，A鏈含21個(gè)氨基酸殘基，B鏈含30

個(gè)氨基酸殘基，鏈間有兩對(duì)二硫鍵，A鏈上有一對(duì)二硫鍵。.3.功能相似的蛋白質(zhì)往往能顯似它們?cè)谶M(jìn)化上的親緣關(guān)系：比較不同來源的細(xì)胞色素C發(fā)現(xiàn)，與功能密切相關(guān)的氨基酸殘基是高度保守的，這說明不同種屬具有同一功能的蛋白質(zhì)，在進(jìn)化上來自相同的祖先，但存在種屬差異。不同種屬間的同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上相對(duì)應(yīng)的氨基酸差異越大，其親緣關(guān)系愈遠(yuǎn)，反之，其親緣關(guān)系愈近。.14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素不同生物來源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基

不變的AA殘基35個(gè)不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識(shí)別〞并結(jié)合細(xì)胞色素復(fù)原酶和氧化酶。..血紅蛋白的亞基與肌紅蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的保守氨基酸殘基.⒋許多疾病都是由于相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常引起的

基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)改變而產(chǎn)生的遺傳病。稱之為分子病。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的β-亞基上的第六位氨基酸由谷氨酸變成了纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈鐮刀狀。...正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖..

所以，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較種屬來源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是相同。假設(shè)一級(jí)結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)生很大的變化。.二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

肌紅蛋白〔Mb〕與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：.肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)..肌紅蛋白的亞基鐵卟啉..肌紅蛋白的氧合曲線..

Hb由4條肽鏈組成：2α、2β，功能是運(yùn)載O2。在去氧Hb亞基中有以下幾對(duì)離子鍵：..

由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構(gòu)象呈緊張態(tài)，對(duì)氧的親和力很低，第一個(gè)亞基與O2結(jié)合時(shí)，離子鍵的破壞較難，所需要的能量較多。當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象從緊張態(tài)變成松弛態(tài)，其它的離子鍵也依次破壞，此時(shí)破壞離子鍵所需要的能量也少，構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對(duì)氧的親和力大大增強(qiáng)，因此第四個(gè)亞基結(jié)合氧的能力比第一個(gè)大幾百倍。.活動(dòng)肌肉毛細(xì)血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線

....上述Hb與O2結(jié)合后，Hb的構(gòu)象發(fā)生變化，這類變化稱為變構(gòu)效應(yīng)，即通過構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為變構(gòu)蛋白〔allostericprotein〕。血紅蛋白的這種變構(gòu)效應(yīng)能更有效地行使其運(yùn)氧的生物學(xué)功能。.血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)使其有利于氧的運(yùn)輸.

總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。.1.5蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及別離純化1、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其應(yīng)用.2、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)

蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：擴(kuò)散慢、易沉降、粘度大、不能透過半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。

蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。.透析①透析法：把混有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品溶液裝在用玻璃紙，火棉紙等合成材料制成的半透膜透析袋里，然后放入流動(dòng)的〔或經(jīng)常更換的〕蒸餾水中，袋內(nèi)的小分子雜質(zhì)會(huì)不斷擴(kuò)散到半透膜外，直至完全排凈，而蛋白質(zhì)那么留在袋內(nèi)得到純化。②超濾法：是利用一種特制的半透膜，在外加強(qiáng)大壓力作用下，迫使溶液中小分子透過而大分子那么被阻留在濾膜之上而使之純化。如：用(NH2)2SO4分級(jí)后的，需除去(NH4)2SO4應(yīng)采用上述兩種方法之一即可。..3、蛋白質(zhì)的沉淀作用

使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：1〕.鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，參加大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液參加蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和外表的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。.2〕.生物堿試劑沉淀法〔條件：pH稍小于pI〕生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀?！笆潦Y〞的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石〞。3〕.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)外表凈電荷。.4〕.有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，參加能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否那么有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。5〕.重金屬鹽沉淀〔條件：pH稍大于pI為宜〕：在蛋白質(zhì)溶液中參加重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽參加之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害。.

4、蛋白質(zhì)的變性作用1〕.蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，空間構(gòu)象發(fā)生變化，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。2〕.使蛋白質(zhì)變性的因素a.物理因素：高溫、高壓、射線等

b.化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等3〕.變性的本質(zhì)：分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。.4).蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：A生物學(xué)活性消失

B理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反響增強(qiáng)，對(duì)酶的作用敏感，易被水解。.5、蛋白質(zhì)的顏色反響蛋白質(zhì)的顏色反響主要與其定性、定量測(cè)定有關(guān)：a.茚三酮反響：多肽與蛋白質(zhì)都能與之反響生成紫紅色化合物。b.雙縮脲反響：多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑反響，隨著肽鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫紅、紫、藍(lán)。c.酚試劑反響：多肽與蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍(lán)色的化合物。另外，前面提到的氨基酸顏色反響蛋白質(zhì)都具有。.雙縮脲反響Cu2+(鹼性溶液)紅紫色絡(luò)合物蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反響，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物.

6、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)〔280nm處〕有光吸收，主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。其對(duì)紫外光吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷睺rp〕>酪〔Tyr〕>苯丙〔Phe〕。.1.6蛋白質(zhì)的別離純化與測(cè)定一、別離純化蛋白質(zhì)的意義

研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性；提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)；作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。二、蛋白質(zhì)別離純化的一般步驟材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化蛋白質(zhì)的別離純化.1.原料的選擇：要求含待別離的蛋白質(zhì)豐富，廉價(jià)，易得，容易收集，新鮮無腐敗。2.原料的預(yù)處理：如果待別離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；假設(shè)待別離蛋白質(zhì)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)，那么需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷?.從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法。4、純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒?，得到純度比較高的蛋白質(zhì)溶液。純化方法：電泳法、凝膠過濾法、離子交換層析、吸附層析法、親和層析等。.〔1〕原材料預(yù)處理.（2）粗分離

蛋白質(zhì)混合提取液

∣

∣鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑

↓

所要蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分開

特點(diǎn)：簡便、處理量大、既能除去大量雜，又能收縮蛋白質(zhì)溶液

（3）純化

.1）凝膠過濾（凝膠過濾層析，分子排阻層析）

（分子篩層析，凝膠滲透層析）

根據(jù)分子分離蛋白質(zhì)混合物

①凝膠過濾的介質(zhì)

凝膠珠--多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

交聯(lián)度or孔度（網(wǎng)孔大?。瓫Q定凝膠的分級(jí)范圍，即能被該凝膠分離開來的蛋白質(zhì)混合度的分子量范圍

排阻極限－－表示分級(jí)范圍的上限，不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠微孔的最小分子量的分子量

凝膠粒度--篩眼（目）數(shù)，珠直徑表示

－－→與洗脫流速，分辨率有關(guān)

.②凝膠層析.2〕凝膠電泳法：.十二烷基磺酸鈉〔SDS〕SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量

1、蛋白質(zhì)在各種介質(zhì)中〔PAGE〕電泳時(shí)，它的遷移率這樣造成兩個(gè)后果：

①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。

因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比向正極移動(dòng)。

②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。

SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度那么隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。

..3〕離子交換層析采用離子交換樹脂陽離子交換樹脂如：CM—纖維素陰離子交換樹脂如：DEAE—纖維素〔二乙基胺乙基纖維素〕如：CM—維生素：弱酸性物質(zhì)固定相：—COOˉ交換相：H+PH