張鳳麗答辯課件

張鳳麗答辯重組人IFNα-2b治療子宮內(nèi)膜異位癥模型的免疫機(jī)制研究

02級(jí)碩士：張鳳麗導(dǎo)師：謝梅青副教授2前言3研究背景子宮內(nèi)膜異位癥(簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是育齡婦女的常見(jiàn)病，痛經(jīng)、不孕為其主要臨床表現(xiàn)。EM發(fā)病率約10%～15%。不孕婦女中：EM發(fā)病率30%～50%。EM中不孕的發(fā)病率為25%～35%。在慢性盆腔痛患者中經(jīng)腹腔鏡檢證實(shí)有30%～50%是內(nèi)異癥。

---內(nèi)異癥嚴(yán)重影響了婦女的身心健康4研究背景－內(nèi)異癥的病因?qū)W說(shuō)經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)—經(jīng)典學(xué)說(shuō)

體腔上皮化生學(xué)說(shuō)良性轉(zhuǎn)移學(xué)說(shuō)環(huán)境學(xué)說(shuō)基因?qū)W說(shuō)免疫學(xué)說(shuō)－－－研究熱點(diǎn)

5研究背景－內(nèi)異癥的病因?qū)W說(shuō)研究表明76%～90%生育年齡婦女會(huì)發(fā)生經(jīng)血逆流,但只有10%～15%的婦女患子宮內(nèi)膜異位癥。1980年，Weed和Arquemboug就指出子宮內(nèi)膜異位癥是一種與自身免疫有關(guān)的疾病。6研究背景－內(nèi)異癥的病因?qū)W說(shuō)2001年，Nothnick稱內(nèi)異癥為一種自身免疫性疾病。目前學(xué)者們認(rèn)為免疫系統(tǒng)的異常對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的種植、粘附、生長(zhǎng)等各個(gè)環(huán)節(jié)起著重要作用。---免疫學(xué)說(shuō)已獲得普遍認(rèn)同7研究背景－內(nèi)異癥與細(xì)胞免疫T淋巴細(xì)胞是機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞： CD3+代表全部T淋巴細(xì)胞；CD4+代表輔助性T細(xì)胞(Th)；CD8+代表細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)和抑制性T細(xì)胞(Ts)；T淋巴細(xì)胞各亞群失衡－－免疫系統(tǒng)改變8研究背景－內(nèi)異癥與細(xì)胞免疫眾多研究發(fā)現(xiàn)：

內(nèi)異癥患者血清、腹腔液中的CD3、CD4比率及CD4/CD8比值降低，Th與Ts細(xì)胞比例失衡，CD4/CD8比值倒置，指出子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展與患者的細(xì)胞免疫功能低下有關(guān)。---內(nèi)異癥患者多存在細(xì)胞免疫功能缺陷或低下9研究背景－內(nèi)異癥與體液免疫目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者也證明了內(nèi)異癥患者體內(nèi)存在下列抗體增多：

非器官特異性的抗體：抗多核苷酸類、抗組蛋白及抗磷脂、心脂類抗體、抗Laminin-1抗體等

器官特異性抗體：AOA、AEA等

---內(nèi)異癥患者存在體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)10研究背景－內(nèi)異癥與細(xì)胞因子活化的CD4+輔助細(xì)胞分為：

Th1細(xì)胞：IL-2、IL-12和干擾素-γ等，反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)；Th2細(xì)胞：IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)Th1/Th2細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)失衡－－疾病發(fā)生11研究背景－內(nèi)異癥與細(xì)胞因子目前發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者：

Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平發(fā)生了轉(zhuǎn)變，Th1/Th2失衡，Th1向Th2漂移，使子宮內(nèi)膜能夠逃避免疫監(jiān)視及殺傷而在異位種植，引起內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。

---內(nèi)異癥存在Ｔｈ1/Ｔｈ2失衡12研究背景－內(nèi)異癥的治療

藥物

性激素

：

抗性激素類：

手術(shù)：

---此兩種方法均沒(méi)有考慮到內(nèi)異癥患者整體免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)不良反應(yīng)多，復(fù)發(fā)率高，五年復(fù)發(fā)率均在40％左右，效果不理想。單純切除病灶、術(shù)后復(fù)發(fā)率高，易造成新粘連。13研究背景－內(nèi)異癥的免疫治療內(nèi)異癥的免疫病因?qū)W研究進(jìn)展：改善機(jī)體的免疫功能－－新的EM治療法------免疫調(diào)節(jié)劑目前一些免疫抑制劑：

如corticoids(類皮質(zhì)激素)、indomethacin(消炎痛)、pentoxifylline(已酮可可堿)等

------其副反應(yīng)較大，在臨床上受到限制14研究背景－內(nèi)異癥的免疫治療

抗病毒、抗腫瘤干擾素：增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能、提高NK細(xì)胞活性減少IgE的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能

---開(kāi)始在實(shí)驗(yàn)室及臨床應(yīng)用于內(nèi)異癥15研究背景－內(nèi)異癥的免疫治療1999年，IngelmoJM等發(fā)現(xiàn)IFNα-2b腹腔或皮下注射干擾素治療內(nèi)異癥模型，發(fā)現(xiàn)異位病灶明顯縮?。?000年,BahaFateen等采取腹腔內(nèi)一次性置入IFNα-2b治療EM患者，復(fù)發(fā)率降低，妊娠率提高，推測(cè)干擾素可用于內(nèi)異癥的治療。2001年，ShawkyZ.A及2005年，NishidaM等體外也發(fā)現(xiàn)：IFN可抑制異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的DNA合成，促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。

---干擾素可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑用于內(nèi)異癥的治療16研究背景－內(nèi)異癥的免疫治療總結(jié)：IngelmoJM實(shí)驗(yàn)只是單純從用藥前后病灶大小來(lái)推測(cè)干擾素治療效果，用藥的時(shí)間過(guò)短，而B(niǎo)ahaFateen的實(shí)驗(yàn)也是一次性腹腔用藥，ShawkyZ.A及

NishidaM的實(shí)驗(yàn)都是一些體外研究。

---干擾素治療內(nèi)異癥的具體機(jī)理是？17研究立題本研究擬建立SD大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，通過(guò)不同用藥途徑觀察重組人IFNα-2ｂ對(duì)內(nèi)異癥異位病灶的作用，并檢測(cè)內(nèi)異癥大鼠治療后細(xì)胞免疫和體液免疫的多項(xiàng)指標(biāo)，探討重組人IFNα-2ｂ治療子宮內(nèi)膜異位癥的可行性及臨床應(yīng)用前景。18研究目的：1.通過(guò)成功建立SD大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，為研究重組人IFNα-2b對(duì)此病的治療效果提供良好的基礎(chǔ)。2.研究重組人IFNα-2b不同治療方案對(duì)SD大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型病灶的發(fā)生和發(fā)展的抑制作用，探索內(nèi)異癥免疫治療的新方法。

3.研究重組人IFNα-2b對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型細(xì)胞免疫及體液免疫功能的影響，探討治療機(jī)理。19材料與方法20實(shí)驗(yàn)步驟及方法大鼠建模隨機(jī)分組成功后F組

同時(shí)藥物干預(yù)E組G組D組C組B組A組測(cè)量用藥后病灶大小用藥四周后，處死大鼠取血清、全血及病灶流式測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群血清IgG、IgA、IgM的測(cè)定

血清IL-2、IL-4的測(cè)定

取異位病灶及盆腔臟器做病理藥物、安慰劑干預(yù)或不干預(yù)21實(shí)驗(yàn)方法－動(dòng)物模型的建立

自體移植（粘膜面裸露）法

移植物成功的指標(biāo)為：

肉眼觀：體積明顯增大，呈隆起透亮的囊泡狀，內(nèi)部充滿淡黃色或清亮積液，或形成灰白色小結(jié)，部分移植物被結(jié)締組織覆蓋，表面血管清晰可見(jiàn)。

病理示：具有內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)細(xì)胞,部分可見(jiàn)到分泌活動(dòng)。22實(shí)驗(yàn)方法－動(dòng)物模型的建立分組與用藥：

選擇異位病灶生長(zhǎng)良好的大鼠48只，按異位病灶大小分層隨機(jī)法分為五組。E、F組在建模的同時(shí)向腹腔內(nèi)放入不同劑量的干擾素:

A組：腹腔持續(xù)應(yīng)用干擾素組(ｎ=12):10萬(wàn)單位/次,q2w×4w

B組：皮下持續(xù)應(yīng)用干擾素組(ｎ=12)：劑量同上C組：腹腔內(nèi)注射空白對(duì)照組(ｎ=8)：NS0.5ml/次,q2w×4w23實(shí)驗(yàn)方法－動(dòng)物模型的建立D組：皮下注射空白對(duì)照組（n=8）：劑量同上

E組：腹腔單劑量置入干擾素α-2b60萬(wàn)單位組(ｎ=12)F組：腹腔單劑量置入干擾素α-2b120萬(wàn)單位組(ｎ=12)G組：模型空白對(duì)照組（n=8）

于用藥四周后處死大鼠，取組織及血液待檢24實(shí)驗(yàn)方法－移植物肉眼觀

于用藥前后用兩腳規(guī)測(cè)量移植物大小，觀察前后體積（V＝長(zhǎng)×寬×高）變化，并與對(duì)照組相比較。

25實(shí)驗(yàn)方法－病理檢查

在用藥前、后分別隨機(jī)取部分異位病灶組織，處死大鼠時(shí)取肝臟、腎臟臟器連同在位內(nèi)膜做病理觀察，觀察干擾素對(duì)異位病灶的影響及對(duì)臟器器官的改變。

26實(shí)驗(yàn)方法全血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定：

流式細(xì)胞儀測(cè)定法血清IgG、IgA、IgM含量的測(cè)定：

免疫比濁法血清IL-2、IL-4的測(cè)定：

ELISA法27統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Ｘ±s表示，數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較用方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)，各組之間兩兩比較用LSD方法，若方差不齊用Tamhane檢驗(yàn)。各組生長(zhǎng)率相互比較用R×C四格表比較，

P＜0.05為差異有顯著性。28結(jié)果291、動(dòng)物模型制備情況

動(dòng)物建模后的生長(zhǎng)情況

52只SD大鼠有48只建模成功，成功率為92.3％，各個(gè)移植部位的異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況不同：

表1.1.1未干預(yù)時(shí)SD大鼠內(nèi)異癥模型異位病灶的生長(zhǎng)率

建模位置建模例數(shù)生長(zhǎng)例數(shù)生長(zhǎng)率（%）左卵巢系膜484083.3左子宮系膜483777.1小腸系膜483675右腹壁484287.5合計(jì)19215580.7301、動(dòng)物模型制備情況-移植物肉眼觀

建模成功的病灶（小腸系膜上）

建模成功的病灶（卵巢旁）311、

動(dòng)物模型制備情況-病理學(xué)改變未干預(yù)前異位病灶病理改變：異位病灶上皮細(xì)胞呈高柱狀生長(zhǎng)，內(nèi)膜上皮細(xì)胞見(jiàn)核下空泡異位內(nèi)腺體數(shù)目多，腺腔大，腺上皮呈柱狀或乳頭狀，增生現(xiàn)象明顯

322、重組人IFNα-2b對(duì)異位內(nèi)膜干預(yù)時(shí)模型的制備情況:

圖2.1未用藥時(shí)與干擾素干預(yù)時(shí)各個(gè)移植部位的異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況

333、重組人IFNα-2b對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜的影響

34圖3.1重組人干擾素α-2b用藥后肉眼觀察移植物體積變化

*P<0.05與對(duì)照組用藥前后比較；※P<0.05與自組用藥前比；＃A、B組用藥前比較35圖3.2重組人IFNα-2b持續(xù)用藥組對(duì)異位內(nèi)膜病理學(xué)的影響

干擾素皮下持續(xù)用藥后的異位內(nèi)膜上皮及腺體上皮細(xì)胞呈單層分布×40

干擾素腹腔持續(xù)用藥后異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞壞死脫落×4036圖3.3重組人IFNα-2b單劑量置入組對(duì)異位內(nèi)膜病理學(xué)的影響E組用藥后異位內(nèi)膜上皮呈單層，部分細(xì)胞已脫落×40E組用藥后部分上皮細(xì)胞仍呈立方狀分布，核深染，核仁明顯×40F組上皮細(xì)胞部分脫離×40E組在位內(nèi)膜無(wú)明顯變化×40374.重組人IFNα-2b對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠血漿CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞的影響

38圖4.1

各組大鼠血漿CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞水平

395、重組人IFNα-2b對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠血清IgG、IgA、IgM的影響

40圖5.1各組大鼠血清IgG、IgA、IgM水平*P<0.05,與C、D、G組比較416、重組人IFNα-2b對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4的影響

42圖6.1各組大鼠血清IL-2、IL-4水平

*P<0.05與對(duì)照組相比較；▲P<0.05與E組相比較；＃P<0.05與F組相比較43*P<0.05與對(duì)照組相比較；▲P<0.05與E組相比較；＃P<0.05與F組相比較圖6.2各組大鼠血清IL-2/IL-4比值

447、重組人IFNα-2b對(duì)內(nèi)異癥大鼠肝臟、腎臟的病理影響

干擾素用藥后肝臟、腎臟未發(fā)生明顯病理改變45討論46關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型的

建立及意義

自發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥模型

如恒河猴、南美獼猴、狒狒等－－發(fā)病率低，飼養(yǎng)條件高，觀察周期長(zhǎng)，在研究應(yīng)用方面受到限制。

移植性子宮內(nèi)膜異位癥模型如裸鼠、SCID小鼠－－不適于研究機(jī)體免疫方面。47關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型的

建立及意義誘發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥模型獼猴－－價(jià)格昂貴,不易普及；

兔子－－主要應(yīng)用于研究?jī)?nèi)異癥對(duì)卵子釋放、拾卵、卵子運(yùn)送的影響；

大鼠－－性激素水平較高，動(dòng)情周期短且規(guī)律，繁殖能力快，為經(jīng)濟(jì)型動(dòng)物，且模型容易建立，成功率高。48本課題主要是從免疫調(diào)節(jié)方面探討重組人干擾素α-2b治療大鼠內(nèi)異癥模型的機(jī)理，因此采用了SD大鼠制備的EM模型。建模時(shí)間：在動(dòng)情期或動(dòng)情前后期；建模方法：自體移植法依據(jù)學(xué)說(shuō)：子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)；建模部位－－臨床好發(fā)部位------總建模率為92.3％

比RajkumarK等報(bào)道的75％～85％造模成功率高；鄭澄宇等報(bào)道的65%造模成功率高

模型的成功建立為研究干擾素對(duì)此病的影響及觀察其治療效果提供了良好的基礎(chǔ)

49重組人IFNα-2b持續(xù)用藥對(duì)內(nèi)異癥模型

大鼠異位內(nèi)膜的影響

本研究發(fā)現(xiàn)重組人IFNα-2b腹腔注射或皮下注射10萬(wàn)單位持續(xù)用藥可使內(nèi)異癥模型大鼠異位病灶體積明顯縮小。鏡下見(jiàn)異位子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)減少，上皮細(xì)胞呈扁平狀或壞死脫離，內(nèi)異癥大鼠的正位子宮內(nèi)膜也部分出現(xiàn)異位上皮細(xì)胞的萎縮，盆腔內(nèi)粘連減輕。50重組人IFNα-2b持續(xù)用藥對(duì)內(nèi)異癥模型

大鼠異位內(nèi)膜的影響推測(cè)IFN連續(xù)用藥可促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜的萎縮，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療效果良好，皮下用藥與腹腔用藥對(duì)異位內(nèi)膜的影響結(jié)果相似。提示在臨床上我們可以采取較簡(jiǎn)便的應(yīng)用方法－皮下用藥法來(lái)達(dá)到同樣的治療效果。51重組人IFNα-2b單劑量用藥對(duì)SD大鼠

內(nèi)異癥模型的成模干預(yù)作用

本研究發(fā)現(xiàn)在異位內(nèi)膜形成前單劑量應(yīng)用重組人IFNα-2b可明顯降低異位內(nèi)膜的存活率，120萬(wàn)單位對(duì)異位病灶的抑制效果更明顯。病理顯示存活的異位內(nèi)膜腺體和間質(zhì)減少，部分有明顯萎縮。但也有部分病灶呈增生現(xiàn)象。我們可以推測(cè)在異位內(nèi)膜種植于腹腔內(nèi)尚未形成異位病灶之前，預(yù)防應(yīng)用干擾素可以防止子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

52重組人IFNα-2b持續(xù)用藥對(duì)內(nèi)異癥

大鼠細(xì)胞免疫功能的影響

本研究發(fā)現(xiàn)重組人IFNα-2b連續(xù)使用四周后，血清CD3+、CD4＋百分率及CD4+/CD8+比值均見(jiàn)明顯升高，提示干擾素治療后，內(nèi)異癥大鼠體內(nèi)Th增多，Ts減少，提高了內(nèi)異癥模型大鼠細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，加強(qiáng)了機(jī)體對(duì)異位內(nèi)膜的排斥作用，推測(cè)這可能是干擾素持續(xù)用藥有效治療內(nèi)異癥、降低其復(fù)發(fā)率的機(jī)理之一。

53重組人IFNα-2b單劑量用藥對(duì)內(nèi)異癥大鼠細(xì)胞免疫功能的影響本研究發(fā)現(xiàn)重組人IFNα-2b單劑量應(yīng)用后CD4＋T淋巴細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值明顯升高

，與重組人IFNα-2b持續(xù)用藥組相比CD3＋、CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群百分率降低。提示：內(nèi)異癥發(fā)生之前應(yīng)用干擾素可調(diào)整機(jī)體整體免疫水平，從而得以減輕延緩內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。54重組人IFNα-2b單劑量用藥對(duì)內(nèi)異癥大鼠細(xì)胞免疫功能的影響重組人IFNα-2b持續(xù)用藥較單劑量用藥對(duì)改善機(jī)體的細(xì)胞免疫功能效果更好，可能是重組人IFNα-2b用藥時(shí)間與機(jī)體免疫力呈正相關(guān)有關(guān)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可推薦，測(cè)定T細(xì)胞亞群對(duì)于內(nèi)異癥的療效觀察及預(yù)后判斷具有一定的臨床意義。55重組人IFNα-2b對(duì)內(nèi)異癥大鼠

血清IgG、IgA、IgM的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組人IFNα-2b連續(xù)用藥降低了內(nèi)異癥大鼠IgG、IgA

水平，推測(cè)可能在一定程度上降低了內(nèi)異癥模型大鼠過(guò)高的體液免疫功能。預(yù)防性應(yīng)用重組人IFNα-2b可能是抑制了大鼠過(guò)高體液免疫的發(fā)生，從而阻止了內(nèi)異癥的發(fā)生及發(fā)展。

56重組人IFNα-2b持續(xù)用藥對(duì)內(nèi)異癥大鼠

血清IL-2、IL-4的影響

本研究發(fā)現(xiàn)重組人IFNα-2b連續(xù)用藥后內(nèi)異癥模型大鼠IL-2水平明顯升高,IL-2的升高維持了機(jī)體的正常免疫功能。IL-2/IL-4比值的升高提示:重組人IFNα-2b可能逆轉(zhuǎn)了Th1型向Th2型偏移,恢復(fù)了Th1/Th2之間的平衡，這也可能是重組人干擾素α-2b持續(xù)用藥對(duì)內(nèi)異癥治療作用機(jī)理之一。

57重組人IFNα-2b單劑量用藥對(duì)內(nèi)異癥大鼠血清IL-2、IL-4的影響研究表明預(yù)防性應(yīng)用單劑量重組人IFNα-2b不足以以刺激Th1型細(xì)胞活化或使活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。重組人IFNα-2b單劑量的置入預(yù)防性地減少了Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而預(yù)防了Th1型細(xì)胞因子向Th2偏移，此可能是預(yù)防內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)理之一。

58重組人IFNα-2b單劑量用藥對(duì)內(nèi)異癥大鼠血清IL-2、IL-4的影響臨床上，內(nèi)異癥手術(shù)后的復(fù)發(fā)率50％左右，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)手術(shù)后預(yù)防性腹腔內(nèi)放置重組人IFNα-2b可能會(huì)預(yù)防內(nèi)異癥的復(fù)發(fā)。

59重組人IFNα-2b對(duì)內(nèi)異癥大鼠

肝臟、腎臟的影響

重組人IFNα-2b持續(xù)用藥或單劑量用藥，內(nèi)異癥大鼠的肝臟及腎臟組織未出現(xiàn)明顯病理變化，推測(cè)單劑量或連續(xù)應(yīng)用重組人IFNα-2b還不足以導(dǎo)致機(jī)體臟器發(fā)生器質(zhì)性改變，但是否對(duì)內(nèi)異癥大鼠造成遠(yuǎn)期影響還需進(jìn)一步探討。

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