蔗糖酶理論講授2012813課件

三、實驗步驟及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的純化3、各純化級別蔗糖酶的活性測定4、各純化級別蔗糖酶的蛋白質含量測定5、正交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響6、蔗糖酶酶促反應動力學研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量11、蔗糖酶的提取(細胞破壁)自溶法破壁（本實驗）干酵母粉溶于蒸餾水乙酸鈉乙酸乙酯35℃恒溫攪拌40分鐘35℃恒溫過夜補加蒸餾水攪拌均勻，成糊狀離心棄沉淀及脂層E1記錄生產廠家和批號用硫酸紙封嚴（過夜）2E1用稀HAC調pH至4.5乙醇分級(32%乙醇飽和度)Ι離心，取上清乙醇分級(47.5%乙醇飽和度)Ⅱ離心，取沉淀透析磷酸緩沖液5mmol/LpH6.0

過夜離心，取上清E2E2E3DEAE-52離子交換層析E3E4Sephadex-G100凝膠層析

2、蔗糖酶的純化31.酶的蛋白屬性；2.調節(jié)酶溶解度的方法；有機溶劑分級沉淀3.根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法；透析、凝膠層析4.根據(jù)酶分子電荷性質的分離方法；離子交換層析5.根據(jù)酶分子專一性結合的方法;酶的純化方法42.調節(jié)酶溶解度的方法；酶的純化方法（1）改變離子強度；鹽溶/鹽析硫酸銨分級沉淀（反抽提法）（2）改變pH或溫度；（3）改變介電常數(shù)；有機溶劑分級沉淀：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。親水性有機溶劑加入溶液后降低介質的介電常數(shù)，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。親水性有機溶劑的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了表面水化膜的厚度，降低其親水性，導致脫水凝集。5

有機溶劑分級沉淀操作條件的控制

溶劑選擇常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機溶劑的選擇主要應考慮沉淀作用強、對生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。溫度使用有機溶劑沉淀生物大分子時應控制在低溫下進行。樣品濃度的控制

一般認為蛋白質的初始濃度為0.5%-2%為好。64.根據(jù)酶分子電荷性質的分離方法；酶的純化方法離子交換層析基本原理：

以離子交換劑為固定相，以特定的離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結合力的差異，而將混合物中不同離子進行分離的層析技術。在介質中帶正電的物質用陽離子交換劑；帶負電物質用陰離子交換劑93、蔗糖酶的活性測定酶活力

(enzymeactivity)酶催化某一反應的能力——VV——單位時間內單位體積中

底物(substrate)

的減少量或

產物(product)

的增加量10國際單位（IU）：在特定的條件下，每分鐘催化1μmol底物轉化為產物所需的酶量。催量單位（kat）：在特定條件下，每秒鐘使1mol底物轉化為產物所需的酶量。1IU=16.67×10-9kat

酶活力單位：2、酶活力和比活力表示方式11活力

(或總活力)涉及在樣品中酶的總單位，而比活力是酶純度的量度，是每毫克酶的催化活力數(shù)(U/mg蛋白)。在酶的純化過程中它的比活力逐漸升高，當酶提純時，其比活力值成為最大和恒定。酶的比活力(specificactivity，也稱比活性）比活力：指每mg蛋白質所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白質來表示。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白質濃度（mg/ml）比活力有時也可用每g或每ml酶含多少個活力單位來表示12

DNS法測定蔗糖酶活力（本實驗）1、3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理：

DNS試劑+

D-葡萄糖氨基化合物

（還原糖）強堿性溶液

沸水?。ㄗ丶t色）2）在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度成一定比例關系（可于比色測定），所以可用DNS比色法測定還原糖的含量。1）2、蔗糖酶活力測定的原理：1）蔗糖酶催化的反應是：

2）蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。(附1)3）該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜質干擾較少。蔗糖D-果糖+

D-葡萄糖蔗糖酶13

3、DNS比色定糖法工作曲線的制作：①取8支血糖管編號1-8，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標準溶液（2mg/ml）、蒸餾水、3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時放入沸水浴中準確反應5分鐘（注意：一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大燒杯代替沸水浴鍋），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的吸光度值。②以葡萄糖(mg)含量為橫坐標、A540值為縱坐標，畫出工作曲線。14蔗糖酶活力的測定：操作：①取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當稀釋過的酶液

2ml，一支中加入0.5ml

1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對照），另一支做測定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中預熱恒溫；分別取2ml5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準確計算時間，3分鐘后于測定管中加入

0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應。②從反應混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準確反應5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。在葡萄糖標準曲線上找到所測定光密度值對應的葡萄糖含量，按下面公式計算酶活力：

[E]=(葡萄糖mg數(shù)×(4.5/0.5)×E的稀釋倍數(shù)/2ml)/215紫外吸收法雙縮脲法Folin-酚法(Lowry法)4、蔗糖酶的蛋白濃度測定16這是測定蛋白質含量最靈敏的經典方法之一，由于方法簡便，靈敏度高，常為實驗室所采用，也是文獻上用得最多的方法之一。

Folin-酚法(Lowry法)

(A)凡含有兩個及兩個以上肽鍵(-CO-NH-)的化合物在堿性溶液中(如Folin-甲試劑)都能與Cu2+作用，形成紫色的復合物；(B)所有的蛋白質均可與Folin-甲試劑反應形成紫色的銅-蛋白質復合物；(C)銅-蛋白質復合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸(Folin-乙試劑)還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺(在一定范圍內)與蛋白質的含量成正比。干擾物質與雙縮脲法相同，而且受它們的影響更大。（附2）原理:17三種蛋白質測定方法比較18正交試驗設計(Orthogonalexperimentaldesign)

是研究多因素多水平的一種設計方法，它是從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交試驗設計是分式析因設計的主要方法。是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法。日本著名的統(tǒng)計學家田口玄一將正交試驗選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。5、正交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響196、蔗糖酶酶促反應動力學研究

酶促反應動力學是研究酶促反應的速度以及影響此速度的各種因素的科學，是酶工程研究中的一個重要內容。201、影響酶促反應速度的因素

pH值溫度酶濃度底物濃度激活劑抑制劑21

2、酶促反應動力學方程式——米氏學說[S]：底物濃度Ｋm：米氏常數(shù)Vmax：最大反應速度V：不同[S]時的反應速度MichaelisLandMentenML.,.BiochemZ.1913,49:333–369.22米氏常數(shù)（Km）的意義

Km值是酶的特征常數(shù)之一，只跟酶的性質有關，而與酶的濃度無關。

Km值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而言，測定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。

1/Km可以表示酶對底物親和力的大小,1/Km越大,表明親和力越大,多底物酶有不同的Km值,最適底物的Km值最小。233、抑制劑對酶活性的影響使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。

酶的抑制劑一般具備兩個方面的特點：

在化學結構上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復合體。24

抑制劑的作用方式

不可逆抑制抑制劑與酶反應中心的活性基團以共價形式結合，引起酶的永久性失活?？赡嬉种?/p>

抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。根椐抑制劑與酶結合的情況，又可以分為兩類（競爭性抑制和非競爭性抑制)25

可逆抑制(1)竟爭性抑制某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。當抑制劑與活性中心結合后，底物被排斥在反應中心之外，其結果是酶促反應被抑制了。竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。

加入競爭性抑制劑后，Km變大，酶促反應Vmax不變。26酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質并不是與底物競爭與酶活性中心結合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調控部位中的-SH基團作用，改變酶的空間構象，引起非競爭性抑制。加入非競爭性抑制劑后，Km不變，但由于Vmax減小，所以酶促反應速度也下降了。

可逆抑制(1)非竟爭性抑制275、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（本實驗）1）將離子交換柱層析得的E3稀釋(pH4.6HAC緩沖液)至30U/mL，共16ml。2）取試管8支，按0—7編號，0為對照管。3）按P146頁表將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35℃水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。4）取16ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。5）于各管中依次按同樣時間間隔加入已保溫過的酶液2ml，記時，立即搖勻。在35℃水浴中準確反應3min。6）按同樣次序和時間間隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，搖勻，終止反應。7）吸取反應混合物0.5ml，加入盛有3mlDNS試劑和1.5ml去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測定A540值287、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SodiumDodecylSulfate,PolyacrylamidGelElectrophoresis,SDS29電泳：是指帶電粒子在電場的作用下，發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電泳技術：指利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術。電泳？30蛋白質分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質分子形成帶有一定凈電荷的分子,在電場下向自身電荷相反的方向移動。313.按比例配好分離膠,用移液槍快速加入，距梳齒下緣約1cm，之后加少許蒸餾水，靜置直到膠與水層間出現(xiàn)清晰界面?！铀賱㏕EMED要在注膠前加入，否則凝結無法注膠?！⒛z過程最好一次性完成，避免產生氣泡?！獾哪康氖菫榱耸狗蛛x膠膠面平整，并排除氣泡?！z聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。4