食品微生物檢驗(yàn)方法

食品微生物檢驗(yàn)方法中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研討院北京陸橋技術(shù)有限有限責(zé)任公司內(nèi)容提要菌落總數(shù)檢測大腸菌群及大腸桿菌檢測金黃色葡萄球菌檢測沙門氏菌檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測菌落總數(shù)測定——菌落總數(shù)的概念菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位分量〔g〕、容積〔ml〕或外表積〔cm2〕內(nèi)，所含能于某種固體培育基上，在一定條件下培育后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)測定——衛(wèi)生學(xué)意義斷定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時(shí)反映食品加工過程能否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評價(jià)提供根據(jù)。通常以為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，那么可思索致病菌污染的能夠性越大，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。FDABAM菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液〔磷酸鹽緩沖液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)延續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別參與滅菌平皿內(nèi)〔每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行〕每皿內(nèi)參與適量平板計(jì)數(shù)瓊脂〔PCA〕35℃，48±2h菌落計(jì)數(shù)FDABAM菌落計(jì)數(shù)方法選擇25~250CFU之間的菌落進(jìn)展計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：N=∑C/〔1*n1+0.1*n2〕*d一切平板的菌落數(shù)都缺乏25CFU，報(bào)告EAPC/ml〔g〕為＜25*1/d。EAPC：estimatedaerobicplatecount一切平板的菌落數(shù)都超越250CFU，但缺乏100/cm2，報(bào)告EAPC/ml〔g〕為最接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。一切平板的菌落數(shù)都超越100/cm2，計(jì)算平板的面積〔直徑為90mm的平板面積為65cm2〕，估計(jì)最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml〔g〕為＞65*100*1/d。無法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA〔LaboratoryAccident〕。最終結(jié)果保管前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。ISO4833-2003菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液〔磷酸鹽緩沖液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)延續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別參與滅菌平皿內(nèi)〔每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行〕每皿內(nèi)參與適量〔12~15mL〕平板計(jì)數(shù)瓊脂〔PCA〕，30±1℃，72±3h菌落計(jì)數(shù)假設(shè)疑心樣品中含有在培育基外表蔓延生長的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一層〔4mL〕水瓊脂。平板疊放不超越6個(gè)ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法選擇延續(xù)2個(gè)稀釋度不超越300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)展計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：N=∑C/〔n1+0.1*n2〕*d一切平板的菌落數(shù)都缺乏15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m固體樣品：NE=m×d-1無菌生長：液體樣品：lessthan1;固體樣品：lessthan1×d-1最終結(jié)果保管前兩位有效數(shù)字。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)闡明由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培育，因此并不是樣品中實(shí)踐的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來。鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的方式存在，因此在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個(gè)細(xì)胞，因此平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位分量、容積或外表積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落構(gòu)成單位〔colonyformingunits，CFU〕報(bào)告。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)要求每個(gè)樣品從開場稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超越15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，防止將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時(shí)間放置，然后倒置培育，可防止菌落蔓延生長。檢樣過程中運(yùn)用稀釋劑做空白對照，用以斷定稀釋液、培育基、平皿或吸管能夠存在的污染。同時(shí)，檢樣過程中應(yīng)在任務(wù)臺上翻開一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無遭到來自空氣的污染。檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為防止與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培育，于4℃放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對照。大腸菌群的定義大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等能否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌〔俗稱大腸桿菌〕、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸桿菌的定義大腸桿菌〔也稱大腸埃希氏菌〕，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC實(shí)驗(yàn)〔靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)〕為++--或-+--的細(xì)菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌〔ETEC〕、致病性大腸桿菌〔EPEC〕、出血性大腸桿菌〔EHEC〕、侵襲性大腸桿菌〔EIEC〕、黏附性大腸桿菌〔EAEC〕。大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培育基中35/37℃培育48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培育24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌〔根據(jù)ISO規(guī)范〕衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要目的，作為食品中的糞便污染目的。食品中檢出大腸菌群，闡明該食品有糞便污染，既能夠有腸道致病菌存在，因此也就有能夠經(jīng)過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，闡明了糞便污染的程度，也反映了對人體安康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染情況的監(jiān)測目的和HACCP實(shí)施效果的評價(jià)目的。大腸桿菌的生物學(xué)特性根本形狀：此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，普通約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈陳列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只需1-4根，普通不超越10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不構(gòu)成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性培育特性：大腸桿菌合成代謝才干強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培育基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形狀：1〕光滑型：菌落邊緣整齊，外表有光澤、潮濕、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；2〕粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；3〕黏液型：常為含有莢膜的菌株。大腸菌群及大腸桿菌測定

——MPN法檢驗(yàn)流程〔FDABAM〕檢樣50g+450ml稀釋液適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的延續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯〔每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管〕，每管接種1mL35℃，24±2h~48±2h沒有產(chǎn)氣管有產(chǎn)氣管報(bào)告陰性接種BGLB肉湯管接種EC肉湯35±℃，48±2h44.5±0.5℃〔水浴培育〕24±2h~48±2h查MPN表報(bào)告結(jié)果產(chǎn)氣管接種EMB平板〔35℃、18~24h〕〔大腸菌群〕從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜面，進(jìn)展革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復(fù)檢產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告結(jié)果〔大腸桿菌〕大腸菌群測定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)闡明MPN檢索表：MPN為最大能夠數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)展延續(xù)系列稀釋，參與培育基進(jìn)展培育，從規(guī)定的反響呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，那么表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或添加10倍。初發(fā)酵和證明實(shí)驗(yàn)：1〕兩步法進(jìn)展了兩次乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。初發(fā)酵和證明實(shí)驗(yàn)所用培育基不同，但都是為了證明培育物能否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣〞。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持浸透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵〔Slowlactosefermentations〕〞來促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。2〕初發(fā)酵陽性管，不能一定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證明實(shí)驗(yàn)后，有時(shí)能夠成為陰性。有數(shù)聽闡明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證明實(shí)驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)踐檢測任務(wù)中，證明實(shí)驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)任務(wù)中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡〔有時(shí)比小米粒還小〕，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有漸漸上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)闡明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充溢氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。假設(shè)對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手悄然打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)思索能夠有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌測定——EMB選擇性分別鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤大腸桿菌測定——EMB選擇性分別鑒別EMB是一種弱選擇性培育基，一些球菌也可在該培育基上生長；高壓滅菌可使得美藍(lán)復(fù)原從而使培育基的顏色呈不均一橘黃色，悄然搖動(dòng)培育基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培育基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培育基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培育細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌無色糞鏈球菌無色大腸桿菌測定——革蘭氏染色根本原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛運(yùn)用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)建。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和構(gòu)造的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，添加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保管初染時(shí)的顏色。大腸桿菌測定——革蘭氏染色GramnegativeGrampositiveGramstraining大腸桿菌測定——革蘭氏染色根本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。大腸桿菌測定——生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-Kovacs’MR紅色不變色++甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色--V-P甲、乙液Citrate生長不生長---IMViC生化實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌——概述根據(jù)<伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊>，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常見的病原菌?？梢鸩糠只撔愿腥荆绨X、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。金黃色葡萄球菌——生物學(xué)特性金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8μm左右，陳列成葡萄串狀，無芽孢，無莢膜。革蘭氏染色陽性，但衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。金黃色葡萄球菌——生長特性金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體廓清，菌量多時(shí)呈渾濁生長。血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、外表光滑，周圍有溶血圈。Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、潮濕，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——方法適用性MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處置的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g〔ml〕的食品。增菌培育法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——直接平板計(jì)數(shù)法檢樣〔50g+450mL稀釋液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)延續(xù)適宜稀釋度

汲取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于3塊90mmBaird-Parker平板上〔做平行實(shí)驗(yàn)〕35℃，45~48h確證實(shí)驗(yàn)報(bào)告或涂布于1塊140mm平板上FDABAM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法檢樣〔50g+450mL稀釋液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的延續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管10%NaClTSB肉湯，每管接種1mL35℃，48±2h從生長的管中接種1環(huán)劃線于Baird-Parker平板上35℃，48h確證實(shí)驗(yàn)報(bào)告含1%丙酮酸鈉FDABAM金黃色葡萄球菌確證實(shí)驗(yàn)1.凝固酶實(shí)驗(yàn)方法：從平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培育18-24h。取肉湯培育物0.3mL同0.5mL凝固酶實(shí)驗(yàn)兔血漿充分混合，置35℃培育，定時(shí)察看能否有凝塊構(gòu)成，至少察看6h。實(shí)驗(yàn)中需同時(shí)做知陽性和陰性對照。結(jié)果斷定：以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)為陽性。部分凝固〔2+和3+〕的必需進(jìn)展生化鑒定加以證明。FDABAM金黃色葡萄球菌確證實(shí)驗(yàn)2.革蘭氏染色對一切的可疑培育物都要進(jìn)展革蘭氏染色。3.生化鑒定過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)葡萄糖厭氧利用實(shí)驗(yàn)甘露醇厭氧利用實(shí)驗(yàn)金葡溶菌酶敏感性實(shí)驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦笇?shí)驗(yàn)〔輔助〕StaphylococcusaureusonDNaseAgarFDABAM

2種葡萄球菌和微球菌的典型特性特性S.aureusS.epidermidisMicrococci過氧化氫酶+++凝固酶+--耐熱核酸酶+--溶菌酶++-厭氧利用葡萄糖++-甘露醇+--ISO金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法檢樣〔xg+9xmL稀釋液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的延續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管modifiedGiolittiandCantonibroth，37℃，24~48h從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中接種1環(huán)培育物于Baird-Parker平板上37℃，48h確證實(shí)驗(yàn)報(bào)告接種10mL于10mL雙料肉湯，接種1mL于9mL單料肉湯。小心的于接種管中培育基頂部傾注一定量的水瓊脂，使其凝固構(gòu)成密封塞。ISO金黃色葡萄球菌確證實(shí)驗(yàn)?zāi)堂笇?shí)驗(yàn)結(jié)果斷定：

-1+2+3+4+negativepositive沙門氏菌屬簡介1880年E.Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分別出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原構(gòu)造復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個(gè)血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200個(gè)。沙門氏菌屬——生物學(xué)特性形狀特征：革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，普通無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。培育特性：沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42℃都可生長，最適生長溫度為37℃，最適pH為6.8~7.8。營養(yǎng)瓊脂平板上：35~37℃培育18~24h，其菌落大小普通為2~3mm，光滑、潮濕、無色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：絕大多數(shù)沙門氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。沙門氏菌屬——生物學(xué)特性沙門氏菌屬的抗原菌體抗原〔O抗原〕外表抗原〔K抗原〕：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原〔H抗原〕纖毛抗原FDABAM沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌25g樣+225mL乳糖肉湯〔肉制品、肉副產(chǎn)品、動(dòng)物產(chǎn)品〕勻質(zhì)2min，室溫放置60±5min混合均勻，測定調(diào)理PH6.8±0.235℃、24±2h選擇性增菌0.1ml+10mlMM〔RV〕1ml+10mlTTB42℃、24h〔水浴培育〕35℃、24h43℃、24h〔水浴培育〕含菌量高含菌量低分別培育劃線接種選擇性培育基〔BS、XLD、HE〕35℃、24~48h〔BS〕生化鑒定每個(gè)平板挑取至少2個(gè)可疑菌〔包括典型和非典型各2個(gè)〕接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面〔LIA高層深4cm〕〔松蓋以堅(jiān)持有氧條件防止產(chǎn)生過多H2S〕35℃、24±2h棄去尿素酶實(shí)驗(yàn)衛(wèi)矛醇、氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚實(shí)驗(yàn)陽性陰性血清學(xué)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)——沙門氏菌的分類報(bào)告結(jié)果生鮮食物、嚴(yán)重污染的食品和動(dòng)物飼料ISO6579沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌25g樣+225mLBPW勻質(zhì)37±1℃、18±2h選擇性增菌0.1ml+10mlRVS1ml+10mlMKTTn41.5±1℃、24±3h37±1℃、24±3h〔水浴培育〕分別培育劃線接種選擇性培育基〔XLD和第二種選擇性培育基，如BS〕37℃、24~48h〔BS〕每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌進(jìn)展純培育和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)37℃、24±3h

生化鑒定TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚實(shí)驗(yàn)血清學(xué)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)——沙門氏菌的分類報(bào)告結(jié)果ISO6579沙門氏菌生化實(shí)驗(yàn)表試驗(yàn)沙門氏菌屬傷寒A型副傷寒B型副傷寒C型副傷寒其他菌屬反應(yīng)%b反應(yīng)%b反應(yīng)%c反應(yīng)%c反應(yīng)%bTSI葡萄糖產(chǎn)酸+100+100+++100TSI葡萄糖產(chǎn)氣-d0+100+++92TSI乳糖產(chǎn)酸-2-100---1TSI蔗糖產(chǎn)酸-0-0---1TSI硫化氫產(chǎn)生+97-10+++92尿素水解-0-0---1賴氨酸脫羧酶+98-0+++95β-牛乳糖反應(yīng)-0-0---2eV-P反應(yīng)-0-0---0吲哚反應(yīng)-0-0---1b：百分率表明并不是所有分離到的沙門氏菌血清型都會顯示+或-的結(jié)果。c：這些百分率不能從現(xiàn)有的文獻(xiàn)中獲得。d：傷寒沙門氏菌不產(chǎn)氣e：亞利桑那亞型腸炎沙門氏菌為乳糖陽性或陰性反應(yīng)，但通常β-牛乳糖反應(yīng)陽性。沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育XLD瓊脂：FDABAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培育物可呈現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落?！堑湫途洌狐S色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改動(dòng)而出現(xiàn)紅色的細(xì)微透明帶。菌名菌落形態(tài)鼠傷寒沙門氏菌紅色，有黑心傷寒沙門氏菌紅色，有黑心弗氏志賀氏菌紅色大腸埃希氏菌黃色，有膽鹽沉淀環(huán)糞鏈球菌-沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育BS瓊脂：FDABAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍的培育基通常開場呈褐色，但伴隨培育時(shí)間的延伸而變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應(yīng)；——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，構(gòu)成灰綠色菌落，周圍培育基不變色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤鼠傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色，無金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠色大腸埃希氏菌棕色至綠色糞鏈球菌-5007144104Blank50115沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育HE瓊脂：FDABAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色中心或幾乎全黑色。——非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心鼠傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心奇異變形桿菌藍(lán)綠色，有或無黑心弗氏志賀氏菌藍(lán)綠色大腸埃希氏菌橙紅色，有膽酸鹽沉淀糞鏈球菌-沙門氏菌檢驗(yàn)生化鑒定TSI：典型反響：斜面產(chǎn)堿〔K〕：紅色；底部產(chǎn)酸〔A〕：黃色；產(chǎn)H2S：黑色〔少數(shù)不產(chǎn)〕菌名生化反應(yīng)腸炎沙門氏菌K/A，產(chǎn)氣，產(chǎn)H2S大腸埃希氏菌A/A，產(chǎn)氣銅綠假單胞菌K/K奇異變形桿菌K/A，產(chǎn)H2S弗氏檸檬酸桿菌A/A，產(chǎn)H2S弗氏志賀氏菌K/A沙門氏菌檢驗(yàn)——幾點(diǎn)留意冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)展15min或在2-8℃，18小時(shí)內(nèi)軟化。為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必需在選擇性培育基上挑取足夠數(shù)量的菌落進(jìn)展生化和血清學(xué)鑒定。進(jìn)展生化反響時(shí)，應(yīng)以純培育物進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽性，而生化反響特征不符合時(shí)，應(yīng)對接種物進(jìn)展純化，用純化后的培育物重新進(jìn)展生化實(shí)驗(yàn)。測試中應(yīng)同時(shí)接種陽性對照菌株。李斯特菌屬簡介<伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊>第9版中，李斯特菌屬有7個(gè)種：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌〔L.monocytogenes〕、英諾克李斯特氏菌〔L.innocua〕、西爾李斯特氏菌〔L.seeligeri〕、威爾斯李斯特氏菌〔L.welshimeri〕、綿羊李斯特氏菌〔L.ivanovvi〕、格氏李斯特氏菌〔L.grayi〕、默氏李斯特氏菌〔L.murrayi〕。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動(dòng)物的感染，也可引起人的感染。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性形狀特征：革蘭氏陽性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2μm，兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長鏈狀，兼性厭氧、無芽孢，普通不構(gòu)成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易零落。20℃培育后可見到很多鞭毛。培育特性：生長溫度為2~42℃〔冷藏不能阻止該菌的生長〕，最適生長溫度為35~37℃。20~25℃培育有動(dòng)力，37℃培育動(dòng)力消逝；在顯微鏡下察看該菌新穎的室溫肉湯培育物可見翻筋斗運(yùn)動(dòng)。在pH3.8~4.4仍能生長，在pH中性至弱堿性〔9.6〕、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長。血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺種血平板可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性FDABAM單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程檢樣25g增菌EB增菌液根底225mL30℃4h參與抑菌劑30℃20h30℃44h選擇性分別培育接種OXA和PALCAM接種OXA和PALCAM35℃24-48h35℃24-48h

生化鑒定TSA-YE純培育30℃24-48h

典型運(yùn)動(dòng)TSB-YE過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)革蘭氏染色溶血實(shí)驗(yàn)

麥芽糖葡萄糖硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn)甘露醇七葉苷鼠李糖木糖SIM動(dòng)力培育24h培育48hISO單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程測試樣品〔xg或xmL〕+9xmL一次增菌培育基〔HalfFraser肉湯〕

30℃培育24±2h1mL培育液參與劃線接種Oxford瓊脂10mL二次增菌培育基中和PALCAM瓊脂〔Fraser肉湯〕35℃或37℃培育48±2h30℃、35℃或劃線接種Oxford瓊脂37℃培育24-48h和PALCAM瓊脂30℃、35℃或37℃培育24-48h

李斯特菌屬確實(shí)證：-

挑取可疑菌接種TSAYE培育基-

過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)-

革蘭氏染色-

動(dòng)力實(shí)驗(yàn)

單核細(xì)胞增生李斯特菌確實(shí)證：-

溶血實(shí)驗(yàn)-

碳源利用實(shí)驗(yàn)-CAMP〔協(xié)同溶血〕實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分別培育OXA瓊脂F(xiàn)DA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。ISO：生長在牛津瓊脂上24h的典型李斯特氏菌呈小〔1mm〕、灰色的菌落外圍是黑色的暈輪；48h后菌落變暗，能夠見到綠色的輝光，直徑約2mm。有黑色的暈輪并且中間凹陷。Oxford瓊脂平板培育于30℃適宜于僅受額外菌群輕度污染的食品，對于受額外菌群重度污染的食品，最好培育于35℃或37℃，由于李斯特氏菌趨于和額外菌群一同生長。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分別培育PALCAM瓊脂菌名生長情況菌落形態(tài)及培養(yǎng)基變化大腸桿菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無變化金黃色葡萄球菌部分抑制菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃糞鏈球菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無變化英諾克李斯特氏菌生長