2023年馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范

三、馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范

馬傳染性貧血（EquineInfectiousAnemia,EIA,簡(jiǎn)稱馬傳貧）,

是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬馬傳貧病毒引起的馬屬動(dòng)物傳染病。我國(guó)

將其列為二類動(dòng)物疫病。

為預(yù)防、控制和消滅馬傳貧，依據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》

及有關(guān)的法律法規(guī)，制定本規(guī)范。

1適用范圍

本規(guī)范規(guī)定了馬傳貧的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、防治措施、

控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)。

本規(guī)范適用于中華人民共和國(guó)境內(nèi)從事馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)、經(jīng)營(yíng)，馬

屬動(dòng)物產(chǎn)品加工、經(jīng)營(yíng)，及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。

2診斷

2.1流行特點(diǎn)

本病只感染馬屬動(dòng)物，其中，馬最易感，騾、驢次之，且無(wú)品種、

性別、年齡的差異。病馬和帶毒馬是主要的傳染源。主要通過(guò)虻、蚊、

刺蠅及螺等吸血昆蟲的叮咬而傳染，也可通過(guò)病毒污染的器械等傳播。

多呈地方性流行或散發(fā)，以7?9月份發(fā)生較多。在流行初期多呈急

性型經(jīng)過(guò)，致死率較高，以后呈亞急性或慢性經(jīng)過(guò)。

2.2臨床特征

本病潛伏期長(zhǎng)短不一，一般為20?40天，最長(zhǎng)可達(dá)90天。

根據(jù)臨床特征，常分為急性、亞急性、慢性和隱性四種類型。

急性型高熱稽留。發(fā)熱初期，可視黏膜潮紅，輕度黃染；隨病

程發(fā)展逐漸變?yōu)辄S白至蒼白；在舌底、口腔、鼻腔、陰道黏膜及眼結(jié)

膜等處，常見鮮紅色至暗紅色出血點(diǎn)（斑）等。

亞急性型呈間歇熱。一般發(fā)熱39（以上，持續(xù)3?5天退熱至

常溫，經(jīng)3?15天間歇期又復(fù)發(fā)。有的患病馬屬動(dòng)物出現(xiàn)溫差倒轉(zhuǎn)現(xiàn)

象。

慢性型不規(guī)則發(fā)熱，但發(fā)熱時(shí)間短。病程可達(dá)數(shù)月或數(shù)年。

隱性型無(wú)可見臨床癥狀，體內(nèi)長(zhǎng)期帶毒。

2.3病理變化

2.3.1剖檢變化

急性型主要表現(xiàn)敗血性變化，可視黏膜、漿膜出現(xiàn)出血點(diǎn)（斑），

尤其以舌下、齒齦、鼻腔、陰道黏膜、眼結(jié)膜、回腸、盲腸和大結(jié)腸

的漿膜、黏膜以及心內(nèi)外膜尤為明顯。肝、脾腫大，肝切面呈現(xiàn)特征

性檳榔狀花紋。腎顯著增大，實(shí)質(zhì)濁腫，呈灰黃色，皮質(zhì)有出血點(diǎn)。

心肌脆弱，呈灰白色煮肉樣，并有出血點(diǎn)。全身淋巴結(jié)腫大，切

面多汁，并常有出血。

亞急性和慢性型主要表現(xiàn)貧血、黃染和細(xì)胞增生性反應(yīng)。脾中

（輕）度腫大，堅(jiān)實(shí)，表面粗糙不平，呈淡紅色；有的脾萎縮，切面

小梁及濾泡明顯；淋巴小結(jié)增生，切面有灰白色粟粒狀突起。不同程

度的肝腫大，呈土黃或棕紅色，質(zhì)地較硬，切面呈豆蔻狀花紋（豆蔻

肝）；管狀骨有明顯的紅髓增生灶。

2.3.2病理組織學(xué)變化

主要表現(xiàn)為肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓等組織器官內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞

明顯腫脹和增生。急性病例主要為組織細(xì)胞增生，亞急性及慢性病例

則為淋巴細(xì)胞增生，在增生的組織細(xì)胞內(nèi)，常有吞噬的鐵血黃素。

2.4實(shí)驗(yàn)室診斷

2.4.1馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）（見附件）。

2.4.2馬傳貧酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（見附件）。

2.4.3馬傳貧病原分離鑒定（見附件）。

2.4.4結(jié)果判定

具備馬傳貧流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化，可做出初步診斷;

2.4.1或2.4.2或2.4.3結(jié)果陽(yáng)性,即可確診。

3疫情報(bào)告

3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)疑似疫情，應(yīng)當(dāng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)

督機(jī)構(gòu)報(bào)告。

3.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告并確認(rèn)后，按《動(dòng)物疫情報(bào)

告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定及時(shí)上報(bào)。

4疫情處理

4.1發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病馬屬動(dòng)物后，畜主應(yīng)立即隔離疑似患病馬

屬動(dòng)物，限制其移動(dòng)，并立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。動(dòng)物防

疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后，應(yīng)及時(shí)派員到現(xiàn)場(chǎng)診斷，包括流行病學(xué)調(diào)查、

臨床癥狀檢查、病理解剖檢查、采集病料、實(shí)驗(yàn)室診斷等，并根據(jù)診

斷結(jié)果采取相應(yīng)防治措施。

4.2在馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)地，確診為馬傳貧病畜后，當(dāng)?shù)乜h級(jí)以上人

民政府畜牧獸醫(yī)行政管理部門應(yīng)當(dāng)劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)；縣級(jí)

以上地方人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門和單位采取隔離、撲殺、銷

毀、消毒、限制易感動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品及有關(guān)物品出入等控制、撲滅措

施。

若呈暴發(fā)流行時(shí)，由當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)行政管理部門，及時(shí)報(bào)請(qǐng)同級(jí)

人民政府決定對(duì)疫區(qū)實(shí)行封鎖，逐級(jí)上報(bào)國(guó)務(wù)院畜牧獸醫(yī)行政管理部

門?？h級(jí)以上人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門和單位采取隔離、撲殺

等強(qiáng)制性控制和撲滅措施，并迅速通報(bào)毗鄰地區(qū)。

4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)

疫點(diǎn)指患病馬屬動(dòng)物所在的地點(diǎn)，一般是指患病馬屬動(dòng)物所在

的養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）；散養(yǎng)時(shí)，是指患病馬屬動(dòng)物所在的自然村（屯）；或

其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營(yíng)單位。

疫區(qū)疫點(diǎn)外延3公里范圍內(nèi)的區(qū)域，包括病畜發(fā)病前3個(gè)月經(jīng)

?；顒?dòng)，可能污染的地區(qū)。疫區(qū)劃分時(shí)注意考慮疫區(qū)的飼養(yǎng)環(huán)境和天

然屏障（如河流、山脈等）。

受威脅區(qū)是指疫區(qū)外延5公里范圍內(nèi)的區(qū)域。

4.2.2封鎖

疫區(qū)封鎖期間，禁止染疫和疑似染疫的馬屬動(dòng)物及其產(chǎn)品出售、

轉(zhuǎn)讓和調(diào)群；繁殖馬屬動(dòng)物要用人工授精方法進(jìn)行配種；種用馬屬動(dòng)

物不得對(duì)疫區(qū)外馬屬動(dòng)物配種；對(duì)可疑馬屬動(dòng)物要嚴(yán)格隔離檢疫；關(guān)

閉馬屬動(dòng)物交易市場(chǎng)。禁止非疫區(qū)的馬屬動(dòng)物進(jìn)入疫區(qū)，并根據(jù)撲滅

疫情的需要對(duì)出入封鎖區(qū)的人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品采取消毒和其

它限制性措施。

4.2.3隔離

當(dāng)發(fā)生馬傳貧時(shí)，要及時(shí)應(yīng)用臨床檢查、血清學(xué)試驗(yàn)等方法對(duì)可

疑感染馬屬動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將馬屬動(dòng)物群分為患病群、

疑似感染群和假定健康群三類。立即撲殺患病群，隔離疑似感染群、

假定健康群，經(jīng)過(guò)3個(gè)月觀察，不再發(fā)病后，方可解除隔離。

4.2.4監(jiān)測(cè)

疫區(qū)內(nèi)應(yīng)對(duì)同群馬屬動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，所有馬屬動(dòng)物每隔1個(gè)月進(jìn)

行一次血清學(xué)監(jiān)測(cè)；受威脅地區(qū)每3個(gè)月進(jìn)行一次血清學(xué)監(jiān)測(cè)。

4.2.5撲殺

患病馬屬動(dòng)物、陽(yáng)性馬屬動(dòng)物在不放血條件下進(jìn)行撲殺。

4.2.6無(wú)害化處理

病畜和陽(yáng)性畜及其胎兒、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病

害肉尸及其產(chǎn)品無(wú)害化處理規(guī)程》進(jìn)行。

4.2.7消毒

對(duì)患病和疑似患病的馬屬動(dòng)物污染的場(chǎng)所、用具、物品嚴(yán)格進(jìn)行

消毒；受污染的糞便、墊料等必須采用堆積密封發(fā)酵1個(gè)月等方法處

理。

4.2.8封鎖的解除

封鎖的疫區(qū)內(nèi)最后一匹陽(yáng)性馬屬動(dòng)物撲殺處理后，并經(jīng)徹底消毒

等處理后，對(duì)疫區(qū)監(jiān)測(cè)90天，未見新病例；且經(jīng)血清學(xué)檢查3次（每

次間隔30天），未檢出陽(yáng)性馬屬動(dòng)物的，對(duì)所污染場(chǎng)所、設(shè)施設(shè)備和

受污染的其它物品徹底消毒，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢查合格后,

方可由原發(fā)布封鎖令機(jī)關(guān)解除封鎖。

5預(yù)防與控制

5.1檢疫

異地調(diào)入的馬屬動(dòng)物，必須來(lái)自非疫區(qū)。

調(diào)出馬屬動(dòng)物的單位和個(gè)人，應(yīng)按規(guī)定報(bào)檢，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)

督機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢疫（應(yīng)包括血清學(xué)檢查），合格后方可調(diào)出。

馬屬動(dòng)物需憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的檢疫證明運(yùn)輸。運(yùn)輸

途中發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病畜時(shí)，貨主及運(yùn)輸部門應(yīng)及時(shí)向就近的動(dòng)物防

疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告，確診后，由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)就地監(jiān)督畜主實(shí)施撲

殺等處理措施。

調(diào)入后必須隔離觀察30天以上，并經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)兩

次臨床綜合診斷和血清學(xué)檢查，確認(rèn)健康無(wú)病，方可混群飼養(yǎng)。

5.2監(jiān)測(cè)和凈化

5.2.1馬傳貧控制區(qū)、穩(wěn)定控制區(qū)采取“監(jiān)測(cè)、撲殺、消毒、

凈化”的綜合防治措施。每年對(duì)全縣6?12月齡的幼駒，用血清學(xué)方

法監(jiān)測(cè)一次。如果檢出陽(yáng)性馬屬動(dòng)物，除按規(guī)定撲殺處理外，應(yīng)對(duì)疫

區(qū)內(nèi)的所有馬屬動(dòng)物進(jìn)行臨床檢查和血清學(xué)檢查，每隔3個(gè)月檢查一

次，直至連續(xù)2次血清學(xué)檢查全部陰性為止。

5.2.2馬傳貧消滅區(qū)采取“以疫情監(jiān)測(cè)為主”的綜合性防治措

施，每縣每年抽查存欄馬屬動(dòng)物的1%（存欄不足10000匹的，抽檢

數(shù)不少于100匹，存欄不足100匹的全檢），做血清學(xué)檢查，進(jìn)行疫情

監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握疫情動(dòng)態(tài)。

6控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)

6.1穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

6.1.1縣級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

A、全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)連續(xù)5年沒有馬傳貧臨床病例；

B、全縣（市、區(qū)或旗）停止注苗一年后，連續(xù)兩年每年抽檢300

匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿300匹全檢），經(jīng)血清學(xué)檢查，全部陰性。

6.1.2市級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.1.3省級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.1.4全國(guó)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全國(guó)所有?。ㄊ?、自治區(qū)）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.2馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

6.2.1縣級(jí)達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)，在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，還應(yīng)

符合以下條件：

全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)后，連續(xù)兩年每

年抽檢200匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿200匹者全檢），血清學(xué)檢查全

部為陰性。

6.2.2市級(jí)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

6.2.3省級(jí)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

6.2.4全國(guó)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全國(guó)所有?。ㄊ?、自治區(qū)）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

附件1

馬傳染性貧血瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)試行操作方法

1檢驗(yàn)用瓊脂板的制備

1.1取高級(jí)瓊脂糖1克或普通瓊脂1.2克直接放入加有500mL

蒸惚水的三角瓶中，配成2%的瓊脂溶液，在沸水浴中煮沸，全融化

后再冷凝，切成1?l.Scn?小塊，裝入干凈砂布袋中，用10倍量自來(lái)

水沖漂兩天，每天換水兩次，然后改用無(wú)離子水沖漂1?2天，每天

換水兩次。將沖漂完畢的瓊脂小塊裝入1000mL三角燒瓶中，同時(shí)加

入500mL無(wú)離子水再加入相當(dāng)于配制1000mL磷酸緩沖液（PBS液）

或硼酸緩沖液（BBS液）的各種鹽類用量，再加入1%硫柳汞溶液10mL,

在沸水浴中使之全融化并混勻。

若是取優(yōu)質(zhì)瓊脂1克時(shí)，可直接放入含有萬(wàn)分之一硫柳汞的

100mL的PBS或BBS液中，用熱水浴融化混勻。

1.2融化后以兩層紗布夾薄層脫脂棉過(guò)濾，除去不溶性雜質(zhì)。

1.3將直徑90mm的平皿放在水平臺(tái)上，每平皿倒入熱融化瓊脂

液15?18mL,厚度約2.5mm左右，注意不要產(chǎn)生氣泡，冷凝后加蓋，

把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存兩周左右。根據(jù)

受檢血清樣品多少亦可采用大、中、小三種不同規(guī)格的玻璃板。10

X16cm的玻璃板加注熱瓊脂液40mL；6X7cm的加注11mL；32X7.6cm

的加注6mLo

瓊脂經(jīng)處理后配成的瓊脂液，可裝瓶中用膠塞蓋好，以防水分蒸

發(fā)，待使用瓊脂板時(shí)，現(xiàn)融化現(xiàn)倒。

1.4打孔

反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打。打孔器為外徑5mm直徑的薄壁型金屬打孔器。

在坐標(biāo)紙上畫好七孔型圖案。把坐標(biāo)紙放在帶有瓊脂板的平皿或玻璃

板下面，照?qǐng)D案在固定位置上用金屬管打孔，將切下的瓊脂板取出,

勿使瓊脂膜與玻璃面離動(dòng)。外周孔徑為5mm,中央孔徑為5mm,孔間

距3mm,如圖1所示。

圖17孔型

(1)(2)

(3)G(4)

(5)(6)

當(dāng)受檢血清數(shù)量多時(shí)，可用如圖2所示的檢測(cè)40份血清的圖案。

圖240孔型

010203040506

+G+G+G+

070809101112

1314151617181920

+G+G+G+G+

2122232425262728

293031323334

+GG+G+

353637383940

注解：圖1、圖2中的“G”字周圍應(yīng)有圓圈。

2抗原

檢驗(yàn)用抗原按馬傳貧瓊擴(kuò)抗原生產(chǎn)制造及檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)。

3血清

3.1檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：能與合格抗原在12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生明顯

致密的沉淀線的馬傳貧血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽(yáng)性反應(yīng)者為

宜，小量分裝，凍結(jié)保存，使用時(shí)要注意防止散毒。

3.2受檢血清：來(lái)自受檢馬的不腐敗的血清，勿加防腐劑和抗凝

劑。

4抗原及血清的添加

打孔完畢，在瓊脂板上端寫上日期及編號(hào)等。在圖1（7孔型）的

中央孔加抗原，2、5孔加檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其余1、3、4、6孔

加入受檢血清。在圖2（40份血清）的孔型所有①②③……數(shù)字號(hào)孔分

別加入受檢馬血清，G為加抗原孔，+為加檢驗(yàn)用包被陽(yáng)性血清孔，

加至孔滿為止。平皿加蓋，待孔中液體吸干后，將平皿倒置，以防水

分蒸發(fā)；瓊脂板則放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤中。置15?30（

條件下進(jìn)行反應(yīng)，逐日觀察3天并記錄結(jié)果。

5判定

陽(yáng)性：當(dāng)檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間只有一條明顯致密

的沉淀線時(shí)，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線；或者陽(yáng)性血

清的沉淀線末端向毗鄰的受檢血清的抗原側(cè)偏彎者，此種受檢血清判

定為陽(yáng)性。

陰性：受檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清

孔與抗原孔之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔

側(cè)偏彎者，此種受檢血清為陰性。

疑似：標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端，似乎向毗鄰

受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎，但不易判斷時(shí)，可將抗原稀釋2倍、4倍、6

倍、8倍進(jìn)行復(fù)試，最后判定結(jié)果。觀察時(shí)間可延至5天。

判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)從不同折光角度仔細(xì)觀察平皿上抗原孔與受檢血

清孔之間有無(wú)沉淀線。

判斷時(shí)要注意非特異性沉淀線。例如當(dāng)受檢馬匹近期注射過(guò)組織

培養(yǎng)疫苗，如乙型腦炎疫苗等，可見與檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的沉淀線

末端不是融合而為交叉狀，兩個(gè)血清間產(chǎn)生的自家免疫沉淀線等。

6溶液的配制

6.1pH7.4的0.Olmol/L磷酸緩沖生理鹽水（PBS液）

6.212水磷酸氫二鈉（NazHPO,?12H20）2.9克

磷酸二氫鉀0.3克

氯化鈉8.0克

無(wú)離子水或蒸儲(chǔ)水加至1000mL

6.3pH8.6硼酸緩沖液（BBS液）

四硼酸鈉8.8克

硼酸4.65克

無(wú)離子水或蒸儲(chǔ)水加至1000mL

6.4硫柳汞溶液

硫柳汞1.?？?/p>

無(wú)離子水或蒸鐳水1000mL

附件2

馬傳染性貧血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）

1總則

本規(guī)程所規(guī)定的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）適用于馬傳染性貧

血（以下簡(jiǎn)稱馬傳貧）的檢疫，也可以用于馬傳貧弱毒苗免疫馬的抗

體監(jiān)測(cè)。

2材料準(zhǔn)備

2.1器材

2.1.1聚苯乙烯微量反應(yīng)板

2.1.2酶標(biāo)儀

2.2抗原、酶標(biāo)記抗體和陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清

2.3試驗(yàn)溶液（配置方法見附錄）

2.3.1抗原稀釋掖

2.3.2沖洗液

2.3.3酶標(biāo)記抗體及血清稀釋液

2.3.4底物溶液

2.3.5反應(yīng)終止液

3操作方法

3.1包被抗原

用抗原稀釋液將馬傳貧ELISA抗原作20倍稀釋，用微量移液器

將稀釋抗原加到各孔內(nèi)，每孔100U1。蓋好蓋，置4（冰箱放置24

小時(shí)。

3.2沖洗

甩掉孔內(nèi)的包被液，注入沖洗液浸泡3分鐘，甩干，再重新注入

沖洗液，按此方法洗3次。

3.3被檢血清

每份被檢血清及陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清均以血清稀釋液作

20倍稀釋，每份被檢血清依次加兩孔，每孔加100口1。每塊反應(yīng)板

均需設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照血清各兩孔，蓋好蓋，置37C水浴作用1小

時(shí)。

3.4沖洗

方法同“3.2”。

3.5加酶標(biāo)記抗體

將酶標(biāo)記抗體用稀釋液作1000倍稀釋。每孔加100H1,蓋好蓋，

置372水浴作用1小時(shí)。

3.6沖洗

方法同“3.2”。

3.7加底物溶液

每孔加新配制的底物溶液100口1,于25P?3(TC避光反應(yīng)10分

鐘。

3.8終止反應(yīng)

每孔滴加終止劑25Ulo

3.9比色

用酶標(biāo)測(cè)試儀在波長(zhǎng)492nm下，測(cè)各孔降解產(chǎn)物的吸收值。

4結(jié)果判定

被檢血清兩孔的平均吸收值與同塊板陰性對(duì)照血清兩個(gè)孔的平

均吸收值之比22,且被檢血清吸收值20.2者，為馬傳貧陽(yáng)性。

5附錄

5.1聚苯乙烯微量板的處理

5.1.1將聚苯乙烯微量板用溫水反復(fù)沖洗，徹底沖掉灰塵。

5.1.2用無(wú)離子水沖洗3?4遍，室溫或37匕溫箱晾干，置無(wú)塵

干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2試液的配制

5.2.1抗原稀釋液:0.Imol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液。

甲液:0.Imol/LpH9.5碳酸鈉溶液,稱取無(wú)水Na2co3IO.6克，

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

乙液：0.Imol/LpH9.5碳酸氫鈉溶液，稱取NaHC038.4克,以

無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

取甲液200mL、乙液700mL混合即成。

5.3沖洗液:0.02mol/LpH7.2PBS-O.05%吐溫-20。

5.3.10.02mol/LpH7.2PBS液

甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液稱取Na2HP04.12H2071.64

克，以無(wú)離子水溶液溶解至1000mL。

乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液稱取NaH2P.2H2031.21克,

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mL。

取甲液360mL,乙液140mL,NaCL38克，無(wú)離子水溶解至5000mLo

5.3.20.02mol/LpH7.2PBS液1000mL,加吐溫-20液0.5mL

混勻即成。

5.3.3酶標(biāo)記抗體和血清稀釋液：

0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐溫-20,加0.1%明膠,加10%健康

牛血清。

5.3.4底物溶液：pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，內(nèi)含0.04%鄰苯

二胺和0.045%過(guò)氧化氫。

5.3.4.1pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液：

甲液0.Imol/L檸檬酸溶液，稱取檸檬酸（C6H8。7?壓0）21.01克

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

乙液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液。

取甲液2