食品微生物檢驗技術(shù)-

第三章培育基和實驗根本操作技術(shù)一、培育基中的主要成分及其作用〔一〕、營養(yǎng)物質(zhì)N源、C源、無機鹽、生長因子、水第一節(jié)培育基1、常用的N源物質(zhì)蛋白胨牛肉膏肉浸汁酵母膏〔1〕蛋白胨有：普通蛋白胨示胨胰蛋白胨〔2〕、牛肉浸液

成份：含氮物：肌酸、嘌吟、核苷酸尿酸肌肽等糖類物質(zhì)：葡萄酒3肝糖、P-已糖生長因子：硫胺、核黃素、泛酸、葉酸等8種B族維生素〔3〕、組織浸液組織浸液，主要為微生物生長繁衍提供可溶性含氮物質(zhì)、核酸降解物、維生素及無機鹽等，補充蛋白胨營養(yǎng)成分的缺乏部分。包括動物組織浸液、植物組織浸液、微生物細胞浸液。

2、糖、醇類物質(zhì)單糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖多糖：淀粉、纖維素、菊糖醇類：甘露醇、衛(wèi)茅醇、甘油〔二〕、水用蒸餾水，不能用自來水〔三〕、凝固劑瓊脂、明膠、血清等

要求：清一色、雜質(zhì)少〔四〕、抑制劑1、作用：鑒定細菌、抑制雜菌的生長繁衍，添加待檢菌的檢出率2、種類：鹽類：氯化鈉、氯化鋰、氰化鉀、亞碲酸鉀〔鈉〕、亞硒酸鈉等染色劑類：煌綠、薔薇酸、結(jié)晶紫、孔雀綠、孟加拉紅、玫瑰紅膽鹽類：豬〔牛、羊〕膽鹽、混合膽鹽、三號膽鹽、去氧膽酸鹽、膽石酸鹽抗菌素：青霉素、鏈霉素、桿菌肽、多粘菌素〔五〕、指示劑1、作用：用于指示鑒別細菌可否利用分解糖醇類物質(zhì)和含氮化合物，產(chǎn)酸產(chǎn)堿的才干。2、常用的指示劑：酚紅、溴甲酚紫、中性紅、中國藍、甲基紅、復(fù)紅、伊紅、美藍、孔雀綠等二、培育基的類型在實驗室中配制的適宜微生物生長繁衍或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培育基(Media)。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培育目的和檢測需求不同，因此培育基的種類很多。我們可根據(jù)某種規(guī)范，將種類繁多的培育基劃分為假設(shè)干類型?！惨弧?、根據(jù)培育基的物理形狀來區(qū)分固體培育基液體培育基半固體培育基1、液體培育基主要用于增菌培育、鑒別性培育2、固體培育基用作微生物的分別、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等3、半固體培育基察看微生物的動力，有時用來保藏菌種?！捕?、根據(jù)培育基的用途來區(qū)分增殖培育基選擇培育基鑒別培育基1、增殖培育基在普通培育基中參與一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以添加這種微生物的繁衍速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培育基稱為增殖培育基。增菌、運送用培育基B2膽鹽乳糖培育基〔BL〕大腸桿菌增菌

B3亞硒酸鹽增菌培育基沙門氏菌增菌

B4亞硒酸鹽半胱氨酸增菌培育基食品中沙門氏菌增菌

B5四硫磺酸鈉亮綠根底培育基沙門氏菌增菌

B6GN肉湯培育基志賀氏菌增菌

B7堿性蛋白胨水培育基霍亂弧菌增菌B87.5%氯化鈉肉湯培育基金黃色葡萄球菌增菌

B9緩沖蛋白胨水培育基沙門氏菌增菌

B10血液增菌培育基血液中細菌增菌

B11SCDLP液體根底培育基化裝品中細菌增菌2、選擇培育基在培育基中參與某種物質(zhì)以殺死或抑制不需求的菌種生長的培育基，稱之為選擇培育基。分別培育用的培育基名稱用途SS瓊脂培養(yǎng)基沙門氏和志賀氏菌屬分離HE瓊脂培養(yǎng)基志賀氏菌分離鑒別伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分離鑒別麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）腸道致病菌分離甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基）綠膿桿菌分離鑒別XLD瓊脂培養(yǎng)基志賀氏、沙門氏菌分離中國藍瓊脂培養(yǎng)基腸道菌分離鑒別堿性瓊脂培養(yǎng)基霍亂弧菌分離高鹽蔡氏瓊脂培養(yǎng)基真菌、酵母菌分離3、鑒別培育基在培育基中參與某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培育后呈現(xiàn)出明顯差別，因此有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培育基稱之為鑒別培育基。鑒別用培育基名稱用途蛋白胨水培養(yǎng)基靛基質(zhì)和霍亂紅試驗乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌發(fā)酵乳糖試驗0.5%乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基腸道菌生化試驗（復(fù)發(fā)酵）半固體培養(yǎng)基動力試驗和菌種保存三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TST）腸桿菌糖發(fā)酵及硫化氫反應(yīng)氰化鉀基礎(chǔ)培養(yǎng)基沙門氏菌分離脫羧酶試驗對照培養(yǎng)基細菌脫羧酶試驗〔三〕培育基制備的根本方法和本卷須知培育基的制備記錄培育基成分的稱取培育基各成份的混合和溶化培育基pH的初步伐正培育基的過濾廓清培育基的分裝培育基的滅菌培育基的質(zhì)量測試培育基的保管1、培育基的制備記錄每次制備培育基均應(yīng)有記錄，包括培育基稱號，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等。記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保管備查，復(fù)制記錄隨制好的培育基一同存放、以防發(fā)生混亂。2、培育基成分的稱取培育基的各種成分必需準(zhǔn)確稱取并要留意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方上面做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取終了后，即移放于右側(cè)。完全稱取終了后，還應(yīng)進展一次檢查。3、培育基各成份的混合和溶化指示劑應(yīng)在調(diào)理好PH值后再參與；煮溶后要補加足水份；不能把培育基煮焦，焦化的不能運用。4、培育基pH的校正滅菌后PH值會下降0.1～0.2，在做培育基校正PH值時，應(yīng)比實踐值高0.1～0.2；PH調(diào)整后，還應(yīng)將培育基煮沸。5、培育基的過濾廓清液體培育基可用濾紙過濾法瓊脂培育基,可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾６、培育基的分裝斜面：1/５管半固體培育基：1/3管高層斜面：1/4～1/3管平板：13~15ml7、培育基的滅菌〔1〕含糖類或明膠的培育基：113℃滅菌15分鐘或115℃滅菌10分鐘?！?〕無糖培育基：121℃滅菌15~20分鐘?！?〕血液、體液和抗生素等以無菌操作技術(shù)抽取后再參與冷卻至約50℃左右的培育基中?！?〕瓊脂斜面培育基應(yīng)在滅菌后冷至55℃-60℃時取出，再擺置成適當(dāng)斜面。8、培育基的質(zhì)量測試〔１〕如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培育基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH?！玻病硨⑷颗嘤湃?6±1°C恒溫箱培育過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去?！玻场秤糜嘘P(guān)的規(guī)范菌株接種1~2管或瓶培育基，培育24～48小時，如無菌生長或生長不好。應(yīng)清查緣由并反復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，那么該批培育基即應(yīng)棄去，不能運用。9、培育基的保管〔1〕根底培育基不能超越兩周〔2〕生化實驗培育基不宜超越一周，〔3〕選擇性或鑒別性培育最好當(dāng)天運用，傾注的平板培育基不宜超越3天。

思索題1、參與培育基中的抑制劑有什么作用，常用的抑制劑有哪些？2、在制備培育基時，將各成份溶化時要留意哪些問題？3、在制備培育基時，如何進展培育基pH的初步伐正？4、如何選擇培育基的滅菌條件？5、如何進展培育基的保管？培育基配制–器材培育基、玻璃器皿天平秤、藥匙培養(yǎng)基配製–儀器殺菌鍋(Autoclave)無菌操作臺(Laminarflow)培育基的配制–裝水以量桶裝取適當(dāng)量蒸餾水於玻璃容器中於玻璃容器上標(biāo)示培育基稱號培養(yǎng)基配製–秤藥放上秤藥紙並歸零以秤藥匙舀出適當(dāng)量培養(yǎng)基(請看培養(yǎng)基罐上說明)培養(yǎng)基配製–溶解培養(yǎng)基傾倒培養(yǎng)基時小心不要沾到玻璃壁上留意事項–配藥結(jié)束清理配藥桌面與天平清洗秤藥匙，擦乾放回藥品放回藥品櫃培養(yǎng)基配製–分裝調(diào)整分注器(Dispensette)刻度分裝試管蓋上試管蓋放入殺菌鍋(Autoclave)滅菌培養(yǎng)基配製–滅菌加水蓋過鐵板放東西關(guān)門調(diào)整溫度時間關(guān)緊洩壓閥留意事項–殺菌鍋的運用留意事項–殺菌釜運用滅菌結(jié)束後，等壓力降回零時才可打開門進入殺菌釜之物品，蓋子不可關(guān)太緊或太鬆留意事項–殺菌釜運用拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培養(yǎng)基配製–平板培養(yǎng)基滅過菌之固態(tài)培養(yǎng)基於無菌操作臺(Laminarflow)內(nèi)倒製平板培養(yǎng)基(Plate)日光燈UV燈風(fēng)扇第二節(jié)、微生物檢驗的根本操作技術(shù)主要內(nèi)容無菌技術(shù)M的接種與分別技術(shù)微生物的培育方法微生物的生長景象與察看一、無菌技術(shù)〔一〕什么是無菌技術(shù)指在微生物實驗任務(wù)中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施?！捕碂o菌環(huán)境無菌室無菌柜超凈任務(wù)臺1、無菌室〔1〕無菌室的構(gòu)造：更衣間、緩沖間、操作間〔2〕無菌室的消毒和防污染每日〔運用前〕紫外線照射〔1~2小時〕.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸〔2小時〕.每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進展消毒。2、超凈任務(wù)臺

超凈臺的運用與保養(yǎng):〔1〕風(fēng)速堅持在0.32-0.48米/秒;〔2〕運用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;〔3〕讓超凈臺預(yù)任務(wù)10－15分鐘;〔4〕運用終了后，用70%酒精將臺面和臺內(nèi)周圍擦拭干凈.〔三〕無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培育基、無菌衣等.消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、任務(wù)臺、手等〔四〕無菌操作1、目的：〔1〕是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；〔2〕是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。2、進入無菌室前的預(yù)備〔1〕、定期檢查無菌環(huán)境的空氣能否符合規(guī)定；〔2〕、用紫外線滅菌處置30~60分鐘；〔3〕、檢查無菌器材能否完備；〔4〕、洗手消毒；〔5〕、手部消毒后，再穿戴無菌任務(wù)服。3、檢驗操作過程的無菌操作要求〔1〕、在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；〔2〕、運用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放?！?〕、在正火焰上方操作；〔4〕、接種器具在運用前、后都必需灼燒滅菌；〔5〕、在接種培育物時，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)?！?〕、不能用嘴直接吸吹吸管?！?〕、帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。無菌操作斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞1.接種環(huán)前端鐵絲部分以酒精燈燒紅來菌，後端鐵棒部分過火無菌操作–取菌技巧12.試管前端過火3.打開試管蓋無菌操作–取菌技巧14.試管傾斜，放入接種環(huán)無菌操作–取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作–取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作–取菌技巧12.自Plate上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培養(yǎng)基，防止空氣中菌體掉入)(方法二：plate反面拿起)無菌操作–取菌技巧21.擠出平安吸球內(nèi)空氣，插上滅過菌之玻璃吸管2.向上為吸，向下為放無菌操作–取菌技巧31.調(diào)整Pipetman刻度(P1000汲取範(fàn)圍200~1000μl)2.插上滅過菌之Tip(用力插緊)無菌操作–取菌技巧43.按鈕壓至第一段(不可壓至最底)4.深化液面下2~4mm無菌操作–取菌技巧45.漸漸釋放按鈕，即可汲取液體無菌操作–取菌技巧41.試管前端過火2.打開試管蓋無菌操作–接菌技巧方法一：以接種環(huán)沾菌，放入新的培養(yǎng)基中接菌方法三：以Pipetman汲取菌液，按鈕壓至最底排出菌液方法二：以平安吸球汲取菌液，放入新的培養(yǎng)基中，向下排出菌液無菌操作–接菌技巧操作時離火源遙遠試管直放，空氣中菌體容易掉入無菌操作–錯誤示範(fàn)無菌操作–錯誤示範(fàn)平安吸球倒放，菌液容易流入吸球內(nèi)平安吸球隨意放置桌面，菌液容易流出至桌上無菌操作–錯誤示範(fàn)Pipetman倒放，菌液容易流入Pipetman內(nèi)留意事項–生物性廢棄物生物性廢棄物放至正確位置以便滅菌二、微生物的接種與分別技術(shù)〔一〕、接種將微生物接到適于它生長繁衍的人工培育基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。１、接種工具和方法接種和分別工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：１〕劃線接種２〕三點接種３〕穿刺接種４〕澆混接種５〕涂布接種６〕液體接種７〕注射接種８〕活體接種(二)、分別純化１、傾注平板法２、涂布平板法傾注平板法〔a〕涂布平板法〔b〕圖解1.菌懸液2.熔化的培育基3.培育物4.無菌水３、平板劃線法平板劃線分別法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法平板劃線法：1、倒平板，標(biāo)志培育基稱號，編號和實驗日期。2、劃線方法

稀釋混合平板法：1、先加菌2、倒平板時留意培育基溫度3、混合均勻三、微生物的培育方法普通培育法〔需氧培育〕厭氧培育法CO2培育法〔一〕、普通培育法〔需氧培育〕培育溫度:25~37℃〔二〕、厭氧培育方法1、簡易的厭氧培育法：〔1〕庖肉培育法〔2〕鐵絲圈厭氧培育法〔3〕焦性沒食子酸法2、厭氧罐法3、厭氧手套箱法A、厭氧缸法厭氧缸是普通的枯燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)呵斥厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培育出來。接種好標(biāo)本的平板或液體培育基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培育。B、厭氧罐法運用：裝入待培育的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合氣(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。C