實用高效液相色譜法的建立糾錯版-第6章-中性樣品：反相與正相HPLC

第6章中性樣品：反相與正相HPLC6-1引言如1-4節(jié)中所論述，HPLC方法建立的最正確途徑由樣品的性質(zhì)決定。本書中所推薦的HPLC方法建立策略按一般樣品或特殊樣品進行分類，見圖1-3。一般樣品又分為中性樣品和離子樣品，離子樣品包括含有一種或多種離子的或可電離的化合物〔如酸、堿、有機鹽〕。本章討論僅含有不可電離化合物的中性樣品。而離子化合物的HPLC方法建立將在第7章中討論；不過這里所討論的許多中性化合物的別離方法也同樣適用于離子樣品。對于同時含有中性和離子樣品的HPLC方法建立在第9章中討論。第一局部反相色譜反相色譜〔RPC〕是別離大多數(shù)常規(guī)樣品的首選別離模式，該模式的普適性一般比其它液相色譜模式更好，更方便，獲得令人滿意的最正確別離效果的可能性更大。RPC色譜柱柱效高、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好〔見5-3節(jié)〕。所采用溶劑的性質(zhì)決定了這種模式往往更易于檢測〔尤其是UV檢測器〕，因此大多數(shù)色譜工作者采用RPC別離模式多于其它HPLC模式。盡管許多有機化合物在〔水溶液〕流動相中溶解度有限，但由于RPC的進樣量很少〔納克或微克〕〔見2-4節(jié)〕，實際上并不會影響其應用。當樣品在RPC流動相中溶解度太小時，正相色譜〔NPC〕那么是較好的選擇。同樣，那些在水溶液中不穩(wěn)定的樣品也可用非水溶劑以NPC模式進行別離。有些樣品用RPC別離較困難，必須采用其它模式進行別離。含下述化合物之一的樣品為特殊樣品〔見圖1-3〕：強親水或強疏水化合物、非手性異構(gòu)體、手性異構(gòu)體〔即對映體，見第12章〕、生物大分子〔見第11章〕。無機離子或合成聚合物也很“特殊〞，但本書中不作討論。強疏水樣品由于在RPC中被強保存，可能需采用非水條件〔非水反相色譜或NARP，見6-5節(jié)〕，正相色譜〔NPC〕也可進行這類別離〔見本章第二局部〕。強疏水的生物大分子那么可采用疏水作用色譜〔HIC〕別離，將在第11章中討論。強親水樣品在RPC中往往保存缺乏，親水離子樣品的別離祥見第7章的討論。由于中性親水化合物在NPC柱上保存很強，用NPC別離很好〔見6-6與6-7節(jié)〕。某些親水化合物也可以采用親水作用色譜〔HILIC〕進行別離〔詳見6-6-5節(jié)與第11章的討論〕。非手性異構(gòu)體〔包括立體異構(gòu)體、非對應異構(gòu)體、位置異構(gòu)體等〕可以采用某些RPC條件別離。但異構(gòu)體混合物通常采用NPC〔見6-7節(jié)〕或以環(huán)糊精鍵合固定相的RPC〔見6-3-3節(jié)〕進行別離，手性對映體的別離須用特殊條件，詳見第12章的討論。6-2反相色譜的保存RPC的保存機理如圖6-1所示。RPC別離類似于從水中萃取不同化合物至有機溶劑〔如辛醇〕，疏水〔非極性〕化合物更易于萃取至非極性的辛醇相中。色譜柱〔一般用C8或C18鍵合相修飾的硅膠擔體〕的極性弱于〔水-有機〕流動相。樣品分子在極性流動相和非極性固定相間進行分配，疏水強的〔非極性〕化合物保存較強。因此，對于一定組成的流動相，樣品依其疏水性，保存值不同，所得色譜圖如圖6-1所示。親水〔極性〕組分保存較弱，先從柱上流出；疏水〔非極性〕組分后流出；中等極性組分居中流出?；衔锏腞PC保存值由其極性和實驗條件〔包括流動相、色譜柱和柱溫〕決定。如表6-1所示，有數(shù)種方式可改變RPC中大多數(shù)組分的保存值。雖然仍不清楚反相保存的詳細機理，但保存值可以通過分配過程近似估算出。不考慮保存機理，人們對改變實驗條件〔流動相、色譜柱、柱溫〕產(chǎn)生的影響已作了深入的研究，因此可以系統(tǒng)地研究RPC的方法建立〔如本章和第9章所述〕。圖6-1非離子樣品的反相別離過程示意圖黑點表示在極性流動相和非極性固定相間分配的樣品分子6-2-1流動相的影響通過改變流動相組成或溶劑強度調(diào)整保存值〔k值〕較好。在RPC中，采用弱極性的強流動相相對溶質(zhì)保存值較小。溶劑的極性可由極性指數(shù)P‘表示〔見附錄Ⅱ中表Ⅱ-2〕。溶劑強度取決于所選用的有機溶劑和其在流動相中的濃度：%B，一般A代表水，B代表有機溶劑，%為體積百分比。方法建立的初始目的是使所有樣品化合物有適宜的保存值。如第2章所述，用等度條件別離樣品時，容許的保存值范圍為0.5<k<20，不過1<k<10一般更好。表6-1RPC中改變保存值的方法減小保存增大保存提高柱極性〔氰基、C4〕降低柱極性〔C8、C18〕降低流動相極性〔提高%B-增加有機溶劑〕〔減少極性有機溶劑〕提高流動相極性〔降低%B-增加水〕〔增加極性有機溶劑〕提高溫度降低溫度6-2-1-1%B的選擇方法建立的有效步驟是先以極強的流動相開始試驗〔如圖6-2中的100%ACN〕。使用強流動相有可能使首次的運行時間很短，強保存化合物可全部流出。〔注意：假設采用100%ACN，在30~40min后仍不出峰，應考慮采用其它方法；見第9章〕。用100%ACN時，全部組分接近于t0流出〔k<0.2〕，所以需減弱流動相。當ACN濃度以20%的步長遞減到80%和60%時，別離效果如圖6-2，但兩次運行首峰〔t0=1.0min，k<0.5〕的保存結(jié)果都不能令人滿意。50%和40%ACN〔都可到達0.5<k<20〕均有足夠的保存。假設流動相非常弱〔<30%ACN〕，那么化合物D的保存值會太長〔k>20，如圖6-3中D線所示〕。注意用50%與40%ACN時，4種化合物均已到達別離，40%ACN的別離度略好一些〔化合物B與C的Rs=2.0〕，其代價是運行時間更長。很多樣品可以采用溶劑強度調(diào)整保存值的方法充分別離。圖6-3用圖6-2的保存數(shù)據(jù)，以logk對%B作圖得到。K=0.5和k=20的橫虛線規(guī)定了保存值可接受時的最小和最大%B值：30%~56%B〔豎虛線〕。RPC保存值與%B依賴關系的研究已很詳盡。logk與%B之間根本呈線性關系〔見圖6-3〕：logk=logkW-Sφ〔6-1〕其中kW是僅以水為流動相〔0%B〕的理論k值，S對特定組分為常數(shù)，φ是有機溶劑在流動相中的體積分數(shù)[φ=〔%B/100〕]。大多數(shù)小分子量〔<500Da〕化合物的S≈4。式6-1和S≈4的結(jié)果說明每減少10%的B相，k值約增大2~3倍，如圖6-2所示。例如當流動相由40%B減少到30%B，化合物D的k值那么由9增至23〔見圖6-3〕。3倍規(guī)那么〔每降低10%B，k值增加大約3倍〕對于快速估算所有樣品組分的保存值均可接受時的最正確%B值非常有用。圖6-2改變有機溶劑濃度對樣品RPC別離的影響條件：15×0.46cmC18柱，流速：1.5ml/min〔t0=1.0min〕。通過系統(tǒng)地降低%B值〔如圖6-2〕來研究樣品保存值，對選擇特定樣品的最正確流動相組成是一種非常簡便的方法。用梯度洗脫那么是另一種更快捷的方案〔見8-2-2節(jié)〕。6-2-1-2流動相強度RPC中的流動相強度由%B和有機溶劑種類共同決定。這些影響見圖6-4中三種常用RPC溶劑：乙腈〔ACN〕，甲醇〔MeOH〕與四氫呋喃〔THF〕的溶劑強度計算圖。圖中的豎線對應位置為具相同流動相強度〔k值〕的%B值。例如：40%ACN的k值和運行時間應與50%MeOH和30%THF相似。標度略不同的流動相強度圖也有報道。這些不同的標度圖非常相似，只能在樣品別離時作為粗略參考〔準確度±5%B〕。圖6-4在RPC方法建立中的應用將在6-3-2和6-4-2-2節(jié)中作深入討論。圖6-3圖6-2中樣品化合物保存值〔logk〕與流動相強度〔%B〕的關系圖圖6-4及其它文獻數(shù)據(jù)認為RPC中溶劑強度順序為：水〔最弱〕<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃〔THF〕<丙醇<二氯甲烷〔最強〕?？梢娙軇姸入S著溶劑極性的降低而增加。附錄Ⅱ中收錄了一些常用溶劑的極性指數(shù)P‘。圖6-4反相HPLC的溶劑強度計算圖除了二氯甲烷與水不混溶外，上述溶劑都可在RPC與水共用。由于二氯甲烷很強，可用于清洗被強保存樣品組分污染的RPC柱〔見5-4-3-2節(jié)〕。乙腈〔ACN〕是流動相中有機溶劑的最正確首選，ACN-水流動相可用于低波長〔185~210nm〕UV檢測，這對于許多樣品是非常必要的〔見3-2-2節(jié)〕。另外，ACN-水流動相的黏度非常低，塔板數(shù)較高而柱壓較低〔二者均為理想性質(zhì)〕。有機溶劑的第二首選是甲醇〔MeOH〕，再者那么是四氫呋喃〔THF〕。這3種溶劑廣泛用于RPC中，控制選擇性與別離〔見6-3-2節(jié)〕。THF的缺點是：UV吸收高，遇氧會發(fā)生反響，更換流動相后色譜柱平衡較慢等。但據(jù)報道THF有獨特的選擇性。用100%ACN無法將樣品洗脫出色譜柱的情況時有發(fā)生，這些強疏水樣品需用更強的流動相〔如高濃度THF-水或THF-ACN〕。流動相不含水的HPLC模式稱為非水反相液相色譜〔NARP〕，詳見6-5節(jié)中的討論。6-2-2色譜柱和柱溫的影響RPC別離通常使用硅膠基質(zhì)的鍵合相柱〔見5-2-3節(jié)〕。樣品的保存值由色譜柱的三個特性決定：柱類型、鍵合相濃度、柱外表積。保存值隨鍵合相的性質(zhì)而有所不同，通常隨鏈長的增加或鍵合相基團疏水性的增強而增大。例如，C18柱的保存值通常略大于C8柱〔包括鍵合相密度等其它條件相同〕。非極性、非離子化合物的RPC保存值通常遵循以下規(guī)那么：〔弱〕未鍵合硅膠≤氰基<C1〔TMS〕<C3<C4<苯基<C8≈C18〔強〕〔6-2〕圖6-5所示為非極性〔蒽〕與極性〔二乙基鄰苯二甲酸鹽〕在不同商品柱上的保存值關系圖。當其它條件等同時，聚苯乙烯與多孔石墨碳柱〔見5-2-3-2節(jié)〕比C18柱的保存更強。柱強度可由鍵合相判定，如氰基柱較弱，而C18柱較強。另外，k值與柱外表積成正比。普通柱填料〔8nm孔隙〕的外表積大約250m2/g，而30nm孔隙顆粒的外表積大約60m2/g。當其它條件相同時，30nm孔隙〔低外表積〕色譜柱的k值大約為8nm孔隙色譜柱的k值的1/4〔60：250〕。因此，大孔隙〔外表積低〕的氰基柱很弱，其保存值大大低于小孔隙〔外表積大〕的C18柱。改變色譜柱強度可以控制樣品的保存值〔k范圍〕，而大多數(shù)情況下，改變?nèi)軇姸取?B〕更為有效和方便。但有兩種例外應注意：疏水性強的組分保存也強，有時即使采用NARP條件〔見6-5節(jié)〕也不可能從強色譜柱〔如小孔隙C18柱〕上洗脫出來。這種情況下用較弱的色譜柱〔如大孔隙的氰基柱〕可能會使樣品較快洗脫出來。同樣，用小孔隙、強保存的C18柱或〔尤其是〕石墨碳柱，那么利于強親水樣品的洗脫。對于非離子樣品，通常柱溫增加10C，k會減少1~2%，因此可通過改變溫度來控制樣品保存值〔k范圍〕，這與改變%B類似。但這種方法在RPC中并不常用，因為改變?nèi)軇姸雀佑行Аτ谑杷詷O強的樣品，在較高溫度下采用極強流動相〔NARP見6-5節(jié)〕和極弱色譜柱效果更好。6-3反相色譜的選擇性調(diào)整樣品保存值k的范圍僅是獲得充分別離的第一步。當整體保存值令人滿意時〔即0.5<k<20〕，可能有必要改善不同譜峰的峰間距或選擇性〔α〕。RPC中用來改變中性樣品選擇性的主要參數(shù)有三個：流動相組成、柱類型和柱溫，其中改變流動相的組成通常最為有效且方便，故應首先考慮。改變溫度雖然非常方便，但對α值的改變通常較小，不過α的很小改變有時可足以別離許多樣品。6-3-1溶劑強度的選擇性降低%B的主要影響是導致各樣品組分的k值增加。如圖6-2所示，%B的改變使化合物A~D的k值發(fā)生了類似的改變。當%B從30%增加到56%時〔0.5<k<20范圍內(nèi)〕，相鄰峰對〔如化合物B/C〕的選擇性〔α〕變化不大，雖然%B的降低使別離度不斷增加。但其它情況下，相鄰峰間距會隨%B顯著變化。這種溶劑強度選擇性的說明見圖6-6的例如。采用60%與50%ACN別離時，A/B是關鍵峰對〔即采用>50%ACN的流動相時，化合物A與B的別離度較差〕。由于降低%ACN能改善A與B的別離，所以當溶劑強度進一步降低至40%ACN時，這兩個峰的別離將更好，如圖6-6所示。當溶劑強度再降低時，峰對C/D的別離效果變差，所以當采用40%ACN時，化合物C與D又成為關鍵峰對。當%B的改變使某峰對的別離度增加而另一峰對的別離度降低時〔如圖6-6〕，關鍵峰對的歸屬也將發(fā)生變化。最正確樣品別離度的理想%B值是兩峰對的別離度相同〔此時兩者都為關鍵峰對〕。在的例如中，采用中間溶劑強度〔45%ACN〕，可獲得最正確別離。圖6-5蒽與二乙基鄰苯二甲酸鹽在不同商品柱上的保存一般來說，%B值有一個適宜的范圍，使樣品中各組分均獲得可接受的k值。在此范圍中，特定的流動相組分〔%B〕能使整體樣品別離度最正確〔如圖6-6的45%ACN〕。最正確溶劑強度〔%B〕的選擇可通過試-湊試驗獲得。40%和50%ACN的運行結(jié)果說明，中間濃度的%ACN可使2個峰對〔A/B和C/D〕都較好地別離。如10-2節(jié)中所述，也可用計算機程序通過最少的運行次數(shù)、更精確的獲得最正確%B值。很多研究說明，通過改變?nèi)軇姸葋砀淖冞x擇性在RPC中往往是非常重要的，這種方法在調(diào)整峰間距方面的一大優(yōu)點是可以通過不同%B值找出樣品的最正確保存值范圍〔0.5<k<20〕。這樣在為獲得充分別離而調(diào)整選擇性時，需要進行的試驗次數(shù)一般不多。例如圖6-7中所示為硝基取代苯衍生混合物別離的溶劑強度選擇性實驗。以60%MeOH作為流動相〔見圖6-7a〕，峰7/8〔箭頭所指〕為關鍵峰對；而采用50%MeOH〔圖6-7c〕峰2/3〔箭頭所指〕為關鍵峰對。本例中的最正確別離是二者中間的流動相組成：55%MeOH〔圖6-7b〕。溶劑強度選擇性的應用主要受樣品保存值范圍的限制[色譜圖中首峰〔a〕與末峰〔z〕的保存值之比kz/ka]，假設保持0.5<k<20，該比值最大可達40，如該比值較大〔如>20〕，可允許的%B變化范圍將很小，以改變%B而使選擇性發(fā)生變化的可能性也很小。當采用梯度洗脫時，這種限制將不太重要〔見8-4-2節(jié)〕。6-3-2溶劑類型選擇性改變有機溶劑類型來改變峰間距與改善別離度是一種常用的方法。按照溶質(zhì)會影響選擇性的那些特征〔包括酸性、堿性、偶極性等〕選用不同的RPC溶劑。不同的有機溶劑可根據(jù)這些特性進行分類〔如圖2-6和6-8所示〕。這種選擇性表示法〔溶劑選擇性三角形〕在2-3-2節(jié)中已有詳述。溶劑分類對實際方法建立的意義在于一般只需選用3種溶劑，即可能將選擇性到達要求的結(jié)果。圖6-8中的3種水溶性溶劑ACN、MeOH、THF的選擇性〔陰影局部〕有很大差異，其紫外吸收和黏度也較適宜，因此推薦這3種溶劑在RPC中作溶劑類型選擇性試驗。通過適當?shù)鼗旌线@3種溶劑可獲得理想的選擇性〔如果特定樣品需要的話〕。圖6-6溶劑強度選擇性：改變有機溶劑百分比對樣品RPC別離的影響條件：15×0.46cmC18柱，流速：1.5ml/min圖6-9所示為一溶劑類型選擇性的典型例如。50%MeOH改為25%THF使4種化合物的流出順序完全逆轉(zhuǎn)，但應注意即使流出順序未發(fā)生逆轉(zhuǎn)，選擇性的這種變化仍是非常有用的。對于關鍵峰對，通過改變一些實驗條件，即使選擇性〔或α值〕有微小增加〔2~5%〕，對獲得較好的別離也可能是非常必要的。圖6-10所示為一個更復雜的溶劑類型選擇例如，采用50%MeOH〔如圖6-10a〕別離取代苯的混合物，重疊峰1/2為關鍵峰對。用THF代替MeOH，改變%B保持相同的溶劑強度〔見圖6-4〕。采用32%THF〔如6-10b〕時1/2的別離很好，但此時2/3又成為關鍵峰對。因此，這兩種流動相的某種混合應能更好地別離該樣品，以50%MeOH和32%THF按1：4比例混合可得到如圖6-10c的結(jié)果。還應注意，本例中當由50%MeOH改為32%THF時，譜峰4~6的相對保存發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。優(yōu)化選擇性時，除ACN、MeOH和THF外，有時也使用二氧六環(huán)、丙醇、二甲亞砜、2-甲氧乙醇等。對于某些樣品，用這些替代溶劑可能提供有益的選擇性差異，但也必須考慮到它們的一些弊端：UV吸收高、柱壓高、以及純度與穩(wěn)定性問題。在RPC中，改變?nèi)軇╊愋屯ǔＪ歉淖冞x擇性、別離多組分中性樣品最有效的措施。因此，在建立復雜樣品的反相別離方法時，調(diào)節(jié)流動相中有機溶劑種類和濃度應作為一種主要手段。6-3-3柱類型對選擇性的影響改變柱類型可改變選擇性。在圖6-11三種不同柱類型的色譜圖中，峰間距確有較大變化。例如峰6和7在苯基和C18柱上的別離效果好于氰基柱。相反，峰6和7在氰基柱上的別離效果好于C8柱。該樣品在這種特定的流動相中，苯基柱的別離最好。改變%B或溶劑類型有可能進一步改變各柱的選擇性，所以對圖6-11的樣品來說，苯基柱可能并非唯一的〔或最好的〕色譜柱。如6-2-2節(jié)中所述，改變柱類型也會改變整體樣品組分的保存值。幾種除莠劑在鍵合官能團不同的3種色譜柱上，采用35%ACN-水進行的別離見圖6-11。溶質(zhì)在“較強的〞C8柱與苯基柱上保存值較大〔且運行時間較長〕，在“較弱的〞氰基柱上那么較小改變色譜柱通常不如改變流動相類型效果明顯，因此，只有在調(diào)整溶劑強度或溶劑類型改變選擇性不成功時，才嘗試改變柱類型來改善選擇性與別離。如果改變色譜柱，必須針對新柱重新優(yōu)化流動相。也有研究說明，氰基、苯基與C8或C18柱的選擇性差異很大。通常應先試驗C8或C18柱，然后再試氰基柱、苯基柱。如果只可以采用一種有機溶劑時，通過改變柱型來改變選擇性那么較有利。例如，樣品需要在UV短波長檢測〔<210nm〕時只有ACN和水可用。如某些樣品組分或全部樣品不穩(wěn)定或可能與流動相發(fā)生反響時，可能需用特殊的有機溶劑。類型相同、來源不同的色譜柱，也可能會影響RPC峰間距。如X牌號的C18柱被替換成Y牌號的C18柱，盡管柱長和直徑相同，選擇性可能發(fā)生改變〔尤其是離子樣品〕，但我們不推薦這種方法。這種選擇性差異由很多原因引起，包括：所采用硅膠的類型、鍵合化學的技術(shù)和類型，是否經(jīng)過封尾處理及其它因素〔見第5章中詳述〕。不同批次的柱填料之間的差異通常難以控制，導致使用一段時間后，柱重現(xiàn)性不好，RPC方法的普適性變差。該問題的討論詳見7-3-3節(jié)。上述建議的一個重要例外是不要用來源不同的色譜柱作為改變選擇性的手段。用多官能團〔聚合物〕硅烷制備的大孔隙RPCC18柱對形狀不同的〔由于分子內(nèi)的聚集〕多環(huán)芳烴〔PAH〕似乎有獨特的選擇性。因此，這種由多官能團硅烷制得的大孔隙柱，適用于PAH樣品混合物的別離。采用PAH測試混合物有可能說明C18鍵合情況與相應柱的選擇性差異，見附錄Ⅴ。選擇性相似的RPC柱在一些HPLC法中可以相互替換，可由附錄Ⅴ中表Ⅴ-2色譜柱的分類中推斷〔亦見圖5-9〕。環(huán)糊精〔CD〕鍵合的柱填料也可用于RPC，尤其是用于別離對映異構(gòu)體〔見12-5節(jié)〕。這些CD柱在別離其它〔非手性〕異構(gòu)體中也很有效。在這方面，CD鍵合柱別離異構(gòu)體可與正相HPLC相比美。見6-6-1節(jié)與圖6-12中的例如。6-3-4溫度對選擇性的影響采用RPC別離中性化合物時，k值通常隨著柱溫升高而降低〔見6-2-2節(jié)〕。然而，非離子溶質(zhì)的選擇性隨溫度變化很大的情況不多。因此，大多數(shù)情況下，改變柱溫對改變非離子化合物的選擇性，進而改變別離的效果不大。但在圖6-13中的情況也可能發(fā)生，化合物2與4是兩種卷曲分子〔鄰-三聯(lián)苯和間-三聯(lián)苯〕，而其余4種化合物是平面稠環(huán)多環(huán)芳烴。當柱溫升高時，平面化合物相對保存值的降低比非平面化合物快。于是關鍵峰2~4在溫度變化時峰間距發(fā)生了變化；峰3在360C時重疊入峰4中，當溫度升高時向峰2遷移，480C時與峰2重疊。而在420C時到達該流動相/固定相系統(tǒng)的最正確峰間距。圖6-7硝基取代苯別離效果與溶劑強度〔甲醇百分含量〕的關系箭頭所指為關鍵峰對6-4反相色譜中非離子樣品的別離條件的優(yōu)化第9章中總結(jié)的RPC方法建立的初始運行方案適用于各種常規(guī)樣品〔離子的或中性的〕。用此方法可以使大多數(shù)中性樣品到達理想的別離。也可以通過其它方式更有效地進行方法建立，尤其那些需另外方法建立實驗、改變選擇性的樣品。本節(jié)中對這樣一些技術(shù)加以闡述，它們包括：圖6-8改進的溶劑選擇性三角形陰影區(qū)域為MeOH、AcN、THF的選擇性圖6-9RPC中溶劑類型的選擇性〔a〕50%MeOH-水；〔b〕25%THF-水；色譜峰：1對-硝基苯酚；2對-二硝基苯；3硝基苯；4苯甲酸甲酯溶劑類型和%B的使用〔見6-4-2-2節(jié)〕1有機溶劑混合使用〔見6-4-2-3節(jié)〕2柱類型及%B的改變〔見6-4-2-4節(jié)〕3不同溶劑和不同柱型的結(jié)合使用〔見6-4-2-5節(jié)〕6-4-1開始為非離子化合物建立RPC方法的初始推薦條件見表1-3的總結(jié)。選取這些參數(shù)必須兼顧別離度、運行時間和柱壓。15或25cm、5μmC8或C18柱為首選，以未經(jīng)緩沖pH的ACN-水為流動相。流速1~2ml/min。為了防止由于室溫變化可能引起的保存值和選擇性變化，柱溫應控制在35~450C之間，但溫度控制對于別離非離子樣品不很重要。如果開始不知道UV檢測的最正確波長，在210nm檢測可能是最正確首選〔見3-2-2節(jié)〕。圖6-10RPC中溶劑類型的選擇性〔a〕50%MeOH-水；〔b〕32%THF-水；〔c〕10%MeOH-25%THF-水。色譜峰：1苯乙醇；2苯酚；33-苯丙醇；42，4-二甲基苯酚；5苯；6二乙基鄰苯二甲酸酯。中性樣品等度別離的RPC方法建立的推薦方法歸納如表6-2。首次實驗采用等度方法或梯度方法均可。此處假設采用等度；如首次應用梯度實驗〔這樣更好〕見8-2-2與9-2-1節(jié)的討論。圖6-2與6-6所示為采用初始等度別離〔100%ACN〕與下面進行的試-湊法實驗，使樣品保存值到達滿意〔0.5<k<20〕。保存太強或太弱的樣品需要特殊處理〔見9-2-2節(jié)〕。另外，假設峰拖尾、柱塔板數(shù)〔N〕較低或峰形不理想，那么應在繼續(xù)進行方法建立實驗前解決。這往往需要采用第7章中所討論的解決方案。6-4-2優(yōu)化選擇性使樣品保存值范圍適宜的%ACN確定之后，可能有必要調(diào)整選擇性以改善別離〔即：使運行時間更短或別離度更佳〕。如本章前面所述，有許多方法可改變選擇性：表6-3中以改變選擇性的優(yōu)先順序列出了一些可能的方法。6-4-2-1溶劑強度〔%B〕的影響改變?nèi)軇姸取?B〕方法簡便，是別離重疊峰的首選。如圖6-6與6-7中所示，調(diào)整%B使保存值范圍適宜時〔0.5<k<20〕，溶劑強度對選擇性的影響通常很顯著。最終選擇%B時應綜合考慮保存值范圍〔0.5<k<20〕、別離度和運行時間。假設%ACN值不能得到適宜的選擇性〔峰重疊〕，那么必須進一步改變實驗條件。當研究用另一方式改變選擇性時，最好重新優(yōu)化%B使0.5<k<20。6-4-2-2溶劑類型與%B的影響對于大多數(shù)中性樣品來說，當有機溶劑由ACN替換為MeOH或THF時，那些以ACN作溶劑時重疊的峰對的峰間距和別離度有可能發(fā)生很大變化。見圖6-14所示的甾體樣品的別離。圖6-14左側(cè)3張色譜圖的流動相分別為24%ACN、45%MeOH與19%THF為流動相，各圖末峰的k=20〔即溶劑強度相同〕。其中24%ACN的峰1和3未分開，而用45%MeOH和19%THF時，該2峰可達基線別離。另外，MeOH和THF的峰4和峰6相對位置發(fā)生了變化。圖6-14也說明改變?nèi)軇r，優(yōu)化%B對選擇性及保存值范圍〔0.5<k<20〕的重要性。在以ACN作溶劑的情況下，24%ACN〔末峰k=20〕及42%ACN〔首峰k=0.5〕均未能將峰1和3分開。這種情況下，即使再進一步調(diào)節(jié)%B〔修飾劑不變〕以改變選擇性，也不可能成功別離該混合物。用MeOH作溶劑，當濃度為45%時〔末峰k=20〕，4/5為關鍵峰對，但濃度為65%時〔首峰k=0.5〕，1/2那么為關鍵峰對。改變%B關鍵峰對也改變時，%B有一中間值可使別離效果最好，48%MeOH可到達最正確別離〔Rs=1.5〕。以THF為溶劑時，濃度在19%<%B<37%范圍內(nèi)保存值可到達0.5<k<20。19%THF時峰1/2為關鍵峰對，而37%THF時峰4/6為關鍵峰對。中間濃度值24%THF別離最好〔Rs=1.9〕。圖6-11柱類型對選擇性的影響色譜柱：ZorbaxSB-CN，SB-苯基，SB-C8，15×0.46cm；流動相：ACN-水〔35：65〕；1.0ml/min；220C；254nmUV檢測圖6-14的別離列舉了簡捷的方法建立策略，該策略適于10種或10種以下組分的樣品別離。第一組實驗的目的為了解%ACN與別離〔Rs及運行時間〕的關系。通常經(jīng)4或5次運行試驗，即可找到最正確%ACN，如圖6-2和6-6所示。如果別離結(jié)果可以接受，那么不需進一步實驗。但對于圖6-14的甾體樣品，僅改變%ACN不能成功地進行別離，因此應試驗其它溶劑。采用溶劑強度計算圖〔圖6-4〕可以很快通過少數(shù)幾次試驗估算出最正確%MeOH。在圖6-14中，48%MeOH在12min內(nèi)別離可以到達〔Rs=1.5〕。如用ACN或MeOH作溶劑，別離度或保存時間均不能滿意，應再作幾次附加實驗，以找出THF濃度的最正確值。在本例中，24%THF可在9min內(nèi)到達Rs=1.9。盡管這是圖6-14中所示的最正確別離效果，但事先并不能預測哪一種溶劑〔ACN、MeOH、THF〕最好。如果溶劑類型和%B的某種結(jié)合可以成功的話，圖6-14的逐步試驗步驟那么可確保用最少的實驗次數(shù)獲得成功的別離。圖6-12采用環(huán)糊精鍵合柱對異構(gòu)體的別離條件：25×0.46cmCyclobondⅠ色譜柱30%ACN-緩沖液〔pH4.5〕；2.0ml/min；350C表6-3改善選擇性的方法a改變?nèi)軇姸葍?yōu)點：簡單方便，在0.5<k<20范圍內(nèi)通過改變%B尋找適宜的α；缺點：控制<時不如改變?nèi)軇┯行?，尤其對于等度洗脫時k〔末峰〕>>k〔首峰〕的樣品；改變?nèi)軇╊愋汀睞CN，MeOH，THF〕優(yōu)點：當僅改變%B缺乏時，改變α值的有效方法〔α值的變化可能比僅改變%B要大〕缺點：由于需要更多的實驗，故不如改變%B方便；混合不同溶劑優(yōu)點：別離一對以上的關鍵峰對時，可提供中間選擇性；擴展了改變?nèi)軇╊愋偷膽梅秶蝗秉c：需要大量實驗——不方便；改變柱類型優(yōu)點：在改變選擇性方面與改變%B的效果相當。當僅有一種溶劑類型〔如ACN〕可用時，改變柱類型那么非常有用；缺點：不方便，因為必須安裝新柱，并需重新平衡。將不同類型色譜柱串聯(lián)起來使用，以獲得中間選擇性的實用價值不大〔而混合溶劑那么較好〕改變柱溫優(yōu)點：如柱溫可以控制，那么非常方便；缺點：α隨柱溫的變化通常小于其它條件；a大致以重要性優(yōu)先順序?？山Y(jié)合使用兩種或兩種以上方法〔如改變柱類型時，同時也可改變?nèi)軇姸群?或溶劑類型〕。表6-2反相方法建立的推薦步驟1調(diào)整%B，使0.5<k<20，〔1<k<10更好〕2檢查峰拖尾或塔板數(shù)低的現(xiàn)象3如果必要，調(diào)整選擇性a微調(diào)%Bb改變有機溶劑c混合有機溶劑d改變柱類型e改變溫度4優(yōu)化柱條件〔柱長、顆粒尺寸、流速〕圖6-13改變柱溫對多環(huán)芳烴混合物選擇性的影響樣品：1蒽；2鄰-三聯(lián)苯；3熒蒽；4間-三聯(lián)苯5苯并[9，10]菲；6芘條件：31.4×0.46cmC18柱，80%ACN-水1.0ml/min；柱溫如圖示6-4-2-3混合有機溶劑的使用圖6-15中列出了另一種優(yōu)化溶劑類型選擇性的有效方法。該方法在保持溶劑強度恒定的同時，按各種可能的比例混合ACN、MeOH和THF。圖6-15中實驗1先調(diào)節(jié)%ACN，使到達0.5<k<20的別離結(jié)果。假設別離不充分，進一步實驗〔實驗2，3……〕直到別離結(jié)果滿意?；趯嶒?的最正確%ACN，從溶劑強度計算圖中〔圖6-4〕選出實驗2〔MeOH〕和3〔THF〕的流動相。實驗4~7的流動相由實驗1~3的流動相按不同比例混合配制。例如，運行4中流動相由等體積的實驗1和2的流動相混合制得。流動相混合流動相的體積實驗1實驗2實驗3實驗411實驗511實驗511實驗6111經(jīng)過圖6-15中的7次實驗，即可得到使樣品獲得最正確別離度的流動相組成。如前所述，該步驟可借助計算機，實現(xiàn)方法建立自動化〔見10-3節(jié)〕。不過，圖6-16的例如說明逐步方法建立如不采用計算機時，可能不必用圖6-15的全部7次實驗。圖6-14溶劑強度和溶劑類型的優(yōu)化樣品：1強的松，2可的松，3氫化可的松，4地塞米松，5皮質(zhì)酮，611-脫氧皮醇條件：15×0.46cmZorbaxC18柱；2.0ml/min；350C；圖6-15基于乙腈、甲醇與四氫呋喃混合液的RPC選擇性優(yōu)化方案。所有流動相強度相等〔見圖6-4〕。圖6-16中的9組分樣品為取代萘的混合物。開始用改變%ACN的方法進行實驗，結(jié)果ACN可得到0.7<k<8〔保存值可接受〕：圖6-16的實驗1。該濃度52%ACN有2組峰對重疊〔2/3，6/7〕，所以需改變選擇性以改善別離。根據(jù)溶劑強度計算圖〔圖6-4〕，下一次實驗〔運行2〕需采用63%MeOH。峰對2/3和6/7在此實行仍重疊。由于峰對6/7在運行1和2中均未分開，所以MeOH和ACN的混合液不可能成功別離該樣品的所有組分?！策@一結(jié)論由圖6-16中實行4的色譜圖證實，但實際工作中無需進行該次實驗〕由于ACN和MeOH的混合液不能別離該樣品，采用THF進行下一實驗〔實驗3〕。所需%B〔39%THF〕的估計值可從溶劑強度計算圖〔圖6-4〕中得到。注意對于某些樣品，圖6-4給出的近似值可能需經(jīng)一次或二次附加運行，以獲得與用ACN的實驗1相似運行時間的%MeOH或%THF。在實驗3中，峰對3/4和8/9發(fā)生重疊，但這些關鍵峰對與在實驗1〔2/3，6/7〕或?qū)嶒?〔1/2，6/7〕中不同。因此將運行3的流動相與運行1或2的流動相進行混合，別離效果將有所改善。圖6-16取代萘的溶劑選擇性實驗的7份色譜圖色譜柱：15×0.46cmZorbaxC8柱；流速：2.0ml/min；溫度：400C；如將實驗2和3的流動相混合〔實驗6，MeOH-THF〕，峰對3/4發(fā)生重疊，峰對1/2那么勉強別離；再將實驗6和3的流動相混合，峰對3/4仍未別離；而混合實驗6與2的流動相可使峰對1/2勉強別離。因此，接下來應試驗混合實驗1和3的流動相。該試驗〔5〕結(jié)果說明色譜圖中所有9個峰均到達了基線別離。由于運行5的關鍵峰對〔6/7〕在實驗3中別離更好，故可將少量實驗3的流動相與大量實驗2的流動相混合，或許能有進一步的改善。對于含1對以上關鍵峰對的別離，最正確流動相組成應是使2對關鍵峰對的別離度相等〔本例中為6/7與3/4或8/9〕。多項研究說明有機溶劑〔ACN、MeOH、THF〕的最正確混合一般不會都用到所有3種溶劑，然而對于困難的別離，實驗7可提供關鍵峰對相對移動的其它選擇性信息。因此，為更有效地進行RPC方法建立，應首先考慮圖6-15中三角形邊緣上的條件〔僅為實驗1~6〕。4種溶劑的實驗7應最后、且只有需要時才進行實驗。圖6-14中所示的方法建立過程可作為圖6-15運行的開始。這樣，用圖6-14實驗找出圖6-15中運行1，2和3的最正確%B值。而對于需要復合條件〔改變?nèi)軇姸群皖愋?，見圖6-14與6-15〕的困難樣品，%ACN、%MeOH與%THF的最正確值在最終運行中得到。這樣，圖6-14與6-15的2種別離方式高度互補，非常有效。更重要的是，那些不需要嚴格控制選擇性的樣品，僅通過幾次實驗即可別離，如圖6-6〔改變%B〕或圖6-14〔利用不同溶劑類型〕所示。6-4-2-4柱類型與%B的影響柱類型〔C8、C18、苯基、氰基〕也可用于改變選擇性，與改變%B結(jié)合使用時尤其有效。不同類型的色譜柱有特定的選擇性，調(diào)整%B可以進一步微調(diào)其選擇性，改變保存時間范圍，也可能縮短別離時間，如圖6-17所示的取代苯甲酸樣品的別離。盡管該樣品并不適于我們對“中性〞樣品的定義，但在低pH值條件下別離，樣品中的所有化合物實際上皆為中性。6-17a所示為用3支不同色譜柱〔C8、苯基、氰基〕、C8柱使樣品保存最大〔末峰k=20〕的%MeOH別離該樣品的色譜圖。此時苯基柱的別離效果最正確，在C8柱上峰4/6局部重疊，而氰基柱上1/2重疊。然而，由于該樣品組成簡單及保存范圍有限，可以用更強的流動相，如圖6-17b所示調(diào)節(jié)有機溶劑濃度可使首峰k=0.5，[如C8柱可用52%MeOH〔b〕替代26%MeOH]。相同色譜柱用不同%MeOH〔如圖6-17a與b〕，峰間距〔即溶劑強度選擇性〕有顯著變化。在每支柱上的通過2次運行可以系統(tǒng)地調(diào)整%MeOH獲得最正確別離度，見圖6-17c。苯甲酸樣品在氰基柱上選用最正確值32%MeOH時，可別離更好，相當于苯基柱的別離效果〔Rs=2.0〕，但運行時間更短〔5min替代13min〕。6-4-2-5不同溶劑與柱類型的結(jié)合使用溶劑種類和柱類型選擇性的結(jié)合使用對于別離極困難的樣品可能有效。圖6-18概述了這種方法。用圖6-15方法，首先在C8或C18柱上研究溶劑種類的選擇性。假設別離結(jié)果滿意，無需再進一步改善選擇性。假設別離不充分，用氰基柱重復圖6-15方法〔注意：一支色譜柱的最正確流動相會與另一柱的不同〕。假設這些實驗結(jié)果仍不滿意，用苯基柱重復圖6-15實驗。圖6-18的步驟已用來別離20種PTH氨基酸混合物。圖6-19所示為各柱型的最正確別離結(jié)果，及采用芐基柱〔與苯基柱相似〕時以5%ACN，15%MeOH與13%THF作流動相獲得的最正確整體別離度〔Rs=1.2〕。注意：該別離效果只是比C8〔Rs=0.9〕或氰基柱〔Rs=1.0〕略好一些。6-5非水反相HPLC圖6-17苯甲酸的混合物在3種類型柱上的別離非水反相色譜法〔NARP〕主要用于強疏水性樣品的別離，這種樣品通常在色譜柱上保存極強或即使采用100%ACN作為流動相時仍然無法洗脫出〔如脂類或合成聚合物〕。NARP別離的流動相通常為高極性〔A〕和低極性〔B〕有機溶劑的混合液。一般來說，A溶劑為ACN或MeOH，B溶劑為THF、氯仿、二氯甲烷、丙酮、甲基-叔-丁基醚〔MTBE〕或這些溶劑的不同混合液。改變%B與強溶劑B的種類可控制樣品的保存值。改變溫度也可用于優(yōu)化別離。圖6-20所示為NARP別離標準品〔b〕與番茄提取液〔c〕混合液中各種胡蘿卜素〔a〕的結(jié)果。番茄紅素〔峰1〕是圖6-20c樣品中含有的主要胡蘿卜素。強疏水樣品一般不溶于水溶劑，這也是采用NARP別離該類樣品的另一個原因。NARP的方法建立類似于使用通常的水-有機溶劑流動相的RPC法。一般首選采用ACN〔A〕和THF〔B〕的混合液作為初始流動相。假設用100%THF，樣品保存仍太強，可以用極性較弱〔更強〕的B溶劑〔如二氯甲烷或氯仿〕替換，但應用二氯甲烷或氯仿時分別要求UV檢測波長不得小于236nm與250nm。目前NARP的使用不多，這可能是因為通常采用二氯甲烷作為B-溶劑限制了低波長UV檢測；很多經(jīng)NARP別離的樣品可采用正相色譜方便地別離。圖6-17取代苯甲酸的混合物在3種類型柱上的別離條件：15×0.46cm5μm柱；流動相見圖示。緩沖液25mM枸櫞酸〔pH2.5〕；2.0ml/min；350C?！瞐〕%MeOH調(diào)整至末峰k=20；〔b〕%MeOH調(diào)整至首峰k=0.5；〔c〕%MeOH調(diào)整至最大別離度。圖6-18溶劑種類與柱類型選擇性結(jié)合的方法建立用C8、氰基和苯基柱，含ACN、MeOH、THF的流動相實驗的示意圖。溶劑強度和運行時間保持恒定。圖6-19圖6-18中方法在別離20種PTH氨基酸中的應用色譜柱：25×0.46cm6μm微粒；〔a〕CN，〔b〕芐基，〔c〕C8；流速：2.0ml/min，柱溫：500C，各色譜柱上每次別離均采用最正確流動相。A/B/C/D：甲醇/乙腈/四氫呋喃/pH2.1磷酸。〔a〕A=9.2/B=1.3/C=21.0/D=67.6；〔b〕A=15.2/B=5.4/C=13.4/D=66.0〔c〕A=0.8/B=26.5/C=4.5/D=68.2。第二局部正相色譜正相色譜〔NPC〕與RPC相反，固定相的極性大于流動相。樣品的保存值隨流動相的極性降低而增加〔與RPC相反〕。一般來說，流動相采用不含水的有機溶劑混合液〔如異丙醇與己烷〕，柱填料為無機吸附劑〔硅膠、有時也用氧化鋁〕或硅膠擔體的極性鍵合相〔氰基、二醇基或氨基〕。NPC可用于別離中性或離子〔或可電離的〕樣品，但以中性樣品為主。NPC別離離子樣品時可以在流動相中使用水，保存機理較為復雜。用NPC別離離子樣品時，通常最好在流動相中參加三乙胺別離堿性化合物；而參加乙酸或甲酸別離酸性化合物。中性樣品采用NPC或RPC別離的效果一般相近，其主要差異在于2種HPLC方法的洗脫順序相反。在NPC中，弱極性〔疏水的〕化合物先流出，強極性〔親水的〕化合物后流出；該性質(zhì)與圖6-1的RPC行為恰恰相反。應用NPC的原因前面已述，見表6-4中的總結(jié)。表6-4使用正相色譜〔NPC〕的理由1樣品在RPC中不保存〔親水性太強〕2樣品在RPC中保存太強〔疏水性太強〕3采用RPC別離不能獲得足夠的峰間距〔α=1〕4樣品含有空間異構(gòu)體，立體異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體5期望回收到大量疏水性樣品組分〔制備色譜〕6樣品溶于非極性溶劑〔假設采用RPC柱，會對直接進樣造成問題〕NPC的優(yōu)缺點見表6-5中總結(jié)。通常，應首先實驗RPC別離模式，但由于表6-4中的原因，有些情況首先用NPC別離可能更好。當初始RPC實驗說明不同溶劑與/或色譜柱均不能充分別離樣品或選擇性達不到預期效果時，那么需要將RPC更換為NPC，見表6-6。圖6-20胡蘿卜素的非水反相〔NARP〕別離條件：25×0.46cmC18柱；8%氯仿-ACN流動相，2.0ml/min；室溫，UV470nm。表6-5正相色譜的特征優(yōu)點缺點1通過改變流動相或柱填料〔尤其是無機填料，如硅膠〕，別離選擇性可以改變很大。2用非水流動相時，色譜柱非常穩(wěn)定。3許多有機化合物在正相溶劑中易溶?！仓苽銱PLC中的突出優(yōu)點〕。4溶劑黏度低，柱壓降較低；5適用于在水溶液中可能分解的樣品。1離子樣品用RPC別離更容易。2溶劑強度的控制比RPC中難預測且更亢長。3NPC柱的塔板數(shù)有時低于RPC柱。4低沸點溶劑更易蒸發(fā)或產(chǎn)生氣泡；尤其在室溫較高時〔不方便〕。5對于原硅膠：a：柱填料吸收水分后，會導致保存值飄忽不定；b：由于溶劑分層及硅膠柱易吸水，不能進行梯度洗脫；6有機溶劑的本錢和處理費用較高。表6-6NPC和RPC的選擇性比擬具有不同官能團的化合物：硅膠柱比C18柱的α值大；NPC極性鍵合相柱與RPCC18的α值非常相似。同系物或含碳數(shù)目不同的化合物：RPC比NPC的α值大；異構(gòu)體：硅膠柱比C18柱的α值大得多；極性鍵合相柱比C18柱的α值大；6-6正相色譜的保存6-6-1一般原理RPC的保存機理類似于分配過程〔如圖6-1〕，而NPC的保存機理類似于吸附過程。圖6-21a所示為一個樣品分子S在含極性溶劑分子E的流動相NPC中的保存過程。在保存之前，柱填料〔吸附劑〕的外表首先覆蓋有一層溶劑分子E。樣品分子S在發(fā)生保存時必須將溶劑分子E置換下來，以提供吸附S的空間。6-6-1-1樣品和溶劑的定位極性樣品和溶劑分子〔如圖6-21中的S與E〕被牢固地吸附于柱填料外表上的極性基團〔吸附位點〕上，硅膠的吸附位點為硅羥基〔-SiOH〕。對于NPC中常用的氰基、氨基或二醇基柱，吸附位點可以為鍵合相配體或硅羥基。極性樣品分子可在剩余烴基〔如己烷或苯〕上吸附一個或多個極性官能團，與吸附的極性基團相反，非極性烴類樣品僅微弱地吸附于吸附位點上，見圖6-21b中極性基團X和Y取代的苯衍生物的吸附示意圖。圖6-21正相保存示意圖。S為樣品分子；E為強溶劑〔B〕分子；X和Y是極性官能團。對于單取代基化合物X-苯和Y-苯〔見圖6-21b〕，極性基團X-或Y-吸附于吸附位點A上。假設基團X-或Y-的極性很大，那么這種吸附也非常強，基團X-或Y-將吸附于或定位于吸附位點上。當同一個分子中存在兩個或更多極性基團時，這些基團不可能同時進行定位〔如圖6-21b所示〕。而極性非常強的溶劑分子也可以參與定位，這對于加強選擇性的控制具有重要的實際意義。極性樣品和溶劑分子與NPC固定相的作用較強烈。因此，NPC通過改變強溶劑〔B〕或色譜柱，通常能夠比RPC更強地控制選擇性。表6-7所示為2種化合物在氧化鋁柱上以用2種不同流動相的NPC別離結(jié)果。當以ACN-苯-戊烷〔ABP〕〔5：10：85〕作流動相時，1，3，5-三硝基苯〔TNB〕和N，N-二甲基-1-萘胺〔DMN〕的保存值相似〔α=1.2〕。流動相換為苯時，選擇性發(fā)生巨大變化〔α=290！〕。這種選擇性的改變是由2種溶質(zhì)和2種強溶劑在固定相外表的作用位點不同而引起的：苯不定位，而ACN定位牢固；溶劑ACN的定位競爭削弱了DMN的強定位，因此其保存值降低。而由于TNB定位并不強〔無極性很強的取代基〕，故ACN的定位對TNB的保存影響較小。這些重要的溶劑選擇性定位效應在6-6-2節(jié)中再作進一步討論。表6-7NPC別離的選擇性：改變流動相的影響a化合物不同流動相的k值ABPb〔5/10/85〕苯1，3，5-三硝基苯5.90.3N，N-二甲基-1-萘胺7.188α=1.2290a色譜柱：25×0.38cm以水鈍化的堿性氧化鋁填裝填。bA乙腈，B苯，P，戊烷溶劑和溶質(zhì)與NPC固定相作用強烈，在溶劑分類與方法建立方面〔見6-7節(jié)〕，需采用與RPC略微不同的方法〔見圖6-15〕。6-6-2流動相的影響NPC流動相的選擇方式與RPC相同。也是先選擇一種弱〔非極性〕溶劑A和一種強〔極性〕溶劑B，然后混合以獲得使樣品到達0.5<K<20的中等極性的流動相。為使保存值足夠大，調(diào)整%B的過程中，應注意選擇性隨%B的變化，以便能對關鍵峰對的別離進行優(yōu)化〔溶劑強度的選擇性；比擬圖6-6與圖6-7中對RPC的討論〕。假設別離仍不充分，可選用另一種不同強度的溶劑，使選擇性發(fā)生另外變化〔見圖6-16〕。如需進一步改善別離，可如圖6-16中RPC方法那樣，試用幾種強溶劑的混合。6-6-2-1溶劑強度NPC中不同溶劑或溶劑混合液的強度可由參數(shù)ε0〔可由實驗測得〕表示。表6-8列出了HPLC中一些常用溶劑的溶劑的ε0值，以硅膠為柱填料〔硅膠與氧化鋁的ε0值見文獻47〕。其它NPC柱填料〔氧化鋁、極性鍵合相〕的相對溶劑強度與表6-8中的變化規(guī)律相同〔溶劑極性越強，ε0值越大〕。這種相似的變化趨勢有助于按NPC需要選用更強〔或更弱〕的B溶劑。表6-8NPC的溶劑強度〔ε0〕和選擇性a溶劑ε0定位堿性UVb己烷、庚烷、辛烷0.00否c2101，1，2-三氟三氯乙烷〔FreonFC-113〕0.02否c235氯仿0.26否c2471-或2-氯丙烷0.28否c225二氯甲烷0.30否c2342-丙醚0.32c2171，2-二氯乙烷0.34否c234乙醚0.38是是219MTBEd0.48是是225乙酸乙酯0.48是否256二氧六環(huán)0.51是是215乙腈0.52是否192THF0.53是是2301-或2-丙醇0.60是e214甲醇0.70是e210a硅膠作為吸附劑b最小UV波長；假設最大基線吸收度〔100%B〕為0.25AUc溶劑堿性與非定位溶劑無關；d甲基-叔-丁醚；e質(zhì)子給體基團導致的不同選擇性選定了弱溶劑和強溶劑之后，可以將其混合以獲得適宜的保存值，見圖6-22所示的2組分樣品在氰基柱上，以MTBE〔極性〕和己烷〔非極性〕混合作流動相進行的別離。隨%MTBE從3%增至12%，運行時間由8min縮短到4min。以硅膠作為吸附劑的很多實驗說明保存值符合Soczewinski方程：logK=c–nlogXB〔6-3〕其中c和n對于特定溶質(zhì)、B溶劑和色譜柱為常數(shù)，XB為B溶劑在流動相中的摩爾分數(shù)。N的大小表示溶質(zhì)分子中極性定位基團的近似數(shù)目。式6-3較可靠的簡化式為：logK=c’–n’log〔%B〕〔6-3a〕同樣，c’和n’對于特定溶質(zhì)、B溶劑和色譜柱也為常數(shù)。圖6-22正相色譜中溶劑強度的影響苯胺〔A〕與苯酚〔P〕的別離；25*0.46cm氰基柱，MTBE-己烷作流動相，1.0ml/min。大量的NPC實驗結(jié)果與式6-3和6-3a〔以硅膠作為填料〕相符一致，實驗數(shù)據(jù)點在很寬的%B范圍內(nèi)落在logK對log〔%B〕作圖的直線上〔式6-3與6-3a〕，直線的斜率一般在1~2之間，因此NPC保存值隨%B的改變滿足“三倍規(guī)那么〞，即%B增加2倍導致K值減小大約三倍。式6-3和6-3a在NPC極性鍵合相柱中的應用尚未進行很詳細的研究，但有人報道式6-1〔用于RPC〕也適于NPC極性鍵合相。三倍規(guī)那么廣泛用于實際工作中NPC保存值的調(diào)整。通過改變強-溶劑種類來改變選擇性時，假設能夠通過調(diào)整%B得到近似的保存值，將非常方便〔如圖6-4中的RPC溶劑強度計算圖〕。圖6-23為硅膠固定相的NPC別離溶劑強度計算圖，而圖6-24為極性鍵合相柱別離的相應計算圖。圖6-23和6-24中所述溶劑包括了NPC中的常用溶劑。由于NPC中溶劑的選擇性效應大于RPC〔例如表6-7所示〕，圖6-23和6-24中所示的關系圖與圖6-4中的RPC溶劑相比，NPC的更為接近。當強度相同〔等ε0〕的NPC流動相混合后，所得混合液的強度往往會改變〔通常ε0更高，強度更大〕。因此，與RPC相比，調(diào)整NPC中流動相強度需要的試-湊試驗一般會更多。6-6-2-2流動相的選擇性與RPC別離的情況相同，NPC的選擇性可以通過改變%B或B溶劑種類來調(diào)整。圖6-22中2峰的順序隨%MTBE由3%變至12%時發(fā)生了反轉(zhuǎn)。因此，在NPC中為保證0.5<k<20調(diào)整%B時，應注意選取的%B使關鍵峰對獲得最大別離度。通過適當改變B溶劑的類型，能使NPC的選擇性發(fā)生較大變化。盡管溶劑的堿性、酸性或偶極性影響RPC的選擇性，而NPC溶劑的定位性質(zhì)相對更為重要，因此，由非定位溶劑如二氯甲烷，變化至定位溶劑如ACN〔見表6-8〕可使選擇性有較大改變。以硅膠柱用3%ACN-己烷作強溶劑〔定位〕不能別離1，5-二硝基萘〔DNN〕和2-丙酮萘〔AN〕〔α=1.0〕，而采用58%CH2CH2-己烷〔非定位〕那么可以將它們分開，α=3.1；亦見表6-7的例如。堿性定位溶劑如胺和醚〔見圖6-8〕與非堿性定位溶劑如酯、腈和硝基化合物的選擇性不同。表6-8總結(jié)了一些常用HPLC溶劑與選擇性有關的性質(zhì)；非定位性、堿性定位和非堿性定位?；衔顳NN和AN可作為溶劑堿性重要性的例如，在硅膠柱上的別離如用3%ACN作為B-溶劑〔非堿性定位〕時，α=1.3。α值的這種改變在HPLC方法建立中非常有用。溶劑類型選擇性的應用在NPC和RPC中同樣有效。圖6-25的優(yōu)化NPC選擇性方案與圖6-15RPC的類似。采用3種B溶劑：非定位、堿性定位、非堿性定位溶劑，按適當比例混合這3種溶劑以控制選擇性變化，使別離度變化加大。圖6-23硅膠作柱填料正相HPLC的溶劑強度計算圖溶劑為甲基-叔-丁基醚〔tBME〕、乙酸乙酯〔EtOAc〕、與2-丙醇〔IPA〕。圖6-24正相HPLC與氰基或二醇基柱的溶劑強度計算圖圖6-25NPC選擇性優(yōu)化方案基于非定位溶劑〔CH2CH2〕、堿性定位溶劑〔MTBE〕、非堿性定位溶劑〔ACN或EtAc〕與己烷的混合，所有流動相的強度相等〔圖6-23或6-24〕6-6-3柱類型的影響常用的NPC色譜柱有氰基柱、硅膠柱、二醇基柱和氨基柱〔大致按分析型別離用途遞減順序排列〕。柱強度的定義與RPC別離的情況類似：硅膠〔強〕≈氧化鋁≧氨基＞二醇基＞氰基。采用原硅膠柱〔與極性鍵合相比〕的NPC具有表6-9中的特點。分析型應用一般用硅膠柱不方便。異構(gòu)體別離以及制備別離宜采用原硅膠柱。表6-9NPC別離中，硅膠與極性鍵合相〔PBP〕別離的比擬特點說明方便性與重現(xiàn)性PBP〔氰基、二醇基、氨基〕柱較好；硅膠柱那么需要控制流動相中水的含量改變流動相后的柱平衡硅膠柱可能需要的平衡時間較長柱穩(wěn)定性硅膠柱與PBP柱都很穩(wěn)定，但硅膠柱的使用壽命更長異構(gòu)體的選擇性硅膠柱較好梯度洗脫不推薦用硅膠柱制備別離由于本錢低、穩(wěn)定性好、柱容量高、且不易污染樣品組分，通常硅膠柱較好正如改變強溶劑可對NPC選擇性有重大影響一樣，改變柱類型也會產(chǎn)生類似效應?！才c氰基柱比〕堿性化合物〔胺類、醚類、酯類、酮類等，見圖6-8〕在氨基和二醇基柱上保存較大，而偶極化合物〔氯代、硝基、腈基取代物〕〔與氨基或二醇基柱比〕在氰基柱上保存更強，這3種色譜柱的選擇性彼此差異很大。圖6-26所示為NPC中柱類型選擇性對燕麥樣品中除莠劑別離與分析影響的例如。燕麥樣品先經(jīng)過萃取、回收被測物，但是由于這種天然產(chǎn)物的復雜性，且除莠劑的含量極低〔100ppb〕，使其無法實現(xiàn)一步HPLC別離。樣品首先在氰基柱上預別離〔如圖6-26a〕，但除莠劑與許多樣品干擾峰發(fā)生重疊。故先收集含有除莠劑及這些干擾物的組分〔用柱切換〕，如圖6-26a中箭頭所示。再將這些組分在二醇柱上用相同流動相進一步別離〔圖6-26b〕。該色譜圖說明除莠劑峰可與氰基柱中的多種干擾分開。然而，除莠劑與干擾峰共流出仍很可觀。再收集圖6-26b中所示除莠劑組分并在硅膠柱上重新進行別離〔如圖6-26c〕。這時除莠劑峰與其它干擾峰完全別離。本例很好地說明了這3種NPC柱選擇性的顯著差異，從1支色譜柱中共流出的化合物可在另1支柱上得到別離。圖6-26綠燕麥提取物中所含除莠劑在氰基、二醇和硅膠柱上的連續(xù)別離〔a〕氰基柱〔b〕二醇柱〔c〕硅膠柱的色譜圖。6-6-4溫度的影響改變溫度通常僅對NPC的峰間距有極小的影響。因此很少采用改變溫度來調(diào)節(jié)NPC的選擇性，但是含有定位溶劑〔如乙腈〕的流動相，其α值的變化與溫度有一定關系。因為在較高溫度下定位溶劑的解吸，以及定位樣品化合物的相對保存值的相應增大都可能會導致α值的變化。然而這種隨溫度改變產(chǎn)生的峰間距變化可以通過改變流動相更有效地實現(xiàn)〔即由定位B-溶劑換成非定位溶劑〕。應該注意雖然在NPC中用溫度改變選擇性不多，但是溫度的變化卻可以明顯地改變樣品中所有化合物的整體保存值。因此，控制別離溫度仍非常重要。6-6-5親水樣品的別離中水溶液流動相的應用強親水樣品在RPC中可能不保存，而在NPC條件下這些樣品卻保存嚴重。強親水樣品在常用于NPC的非水流動相中可能不溶解。一種解決方法是采用可以使用水流動相的特殊NPC柱；糖一般可以采用60~80%ACN-水流動相在氨基柱上進行別離。由于碳水化合物的親水性較強，且氨基柱近于極性，所以采用RPC別離效果較差。這類化合物以RPC保存不太可能。再者，%ACN增大，碳水化合物的保存增大，這也對RPC別離不利。圖6-27a和b所示為幾種糖在氨基柱上的別離，流動相分別為65%和75%ACN。葡萄糖〔G〕和甘露糖〔M〕用65%ACN時保存時間分別為4min和5min，短于用75%ACN〔6min和10min〕。這種流動相極性增加〔65%ACN〕保存值減小的現(xiàn)象說明了該系統(tǒng)的NPC特征。在C8和C18硅膠柱上也可以觀察到NPC保存行為，圖6-27c為中性冠醚DB18C6在2種ODS柱和2種聚合物柱〔Styragrl和Amberlite〕上的保存值〔logk〕對%MeOH-水的變化曲線〔見圖頂部的刻度〕。C18柱上的保存值大約在80%MeOH時到達最低，而在2種聚合物柱上，保存值隨著%MeOH的增加繼續(xù)減小。圖6-27c中的行為可解釋為：在聚合物柱上，所有%MeOH都表現(xiàn)為RPC行為〔%MeOH增大k減小〕。而在硅膠基質(zhì)的C18柱上，當%MeOH較低時表現(xiàn)為類似的RPC行為，當%MeOH較高時那么表現(xiàn)為NPC行為〔%MeOH增大保存值增加〕。這種NPC行為被認為是由于該樣品與柱填料上的剩余極性硅羥基發(fā)生作用所致。類似的NPC行為〔有機溶劑濃度在中間時保存值〕在RPC條件下別離肽時可見到，同樣屬于硅羥基作用。采用水溶液流動相進行的NPC別離一般稱之為親水作用色譜〔HILIC〕，針對這種別離的特殊HILIC柱已設計出〔如聚-2-羥乙基天冬酰胺〕。這類柱通常采用遞減的有機梯度洗脫或遞增的鹽梯度洗脫，也可以采用揮發(fā)性流動相，其洗脫順序從極性最小至極性最大。圖6-28所示為在HILIC柱上采用不同的%ACN-水流動相對衍生寡糖混合物的別離結(jié)果。由于%ACN減少時保存值降低，屬于NPC保存行為。雖然全部樣品化合物的別離需用梯度洗脫，但也應當注意到這種別離模式出色的別離結(jié)果。HILIC已被用來眾多的生物樣品〔如肽、氨基酸、糖；亦見第11章〕。以水-有機溶劑流動相結(jié)合氨基或特殊HILIC柱可以很方便地別離中性和親水性樣品。假設開始方法建立時首先采用梯度洗脫試驗，梯度運行應由有機溶劑〔弱〕至水〔強〕進行過渡。當首先采用等度洗脫時，可以先以水為流動相，然后逐漸增大有機百分比，以獲得與圖6-2中RPC別離相似的漸進別離效果。然而，圖6-27c中所示的雙模式〔RPC/NPC〕保存行為對這類實驗中的某些柱型可能存在其它潛在的麻煩。6-7正相色譜中非離子樣品別離條件的優(yōu)化6-7-1初始條件一般來說，NPC方法建立的一般模式與RPC〔見表6-2〕類似，見表6-10a中的總結(jié)。對于RPC，其最正確柱型和初始流動相溶劑的選擇有限〔通常為C8或C18柱，ACN-水〕；而NPC的選擇范圍較寬。表6-11對初始NPC別離條件的性質(zhì)方案作了系統(tǒng)總結(jié)。表6-10正相方法建立的推薦方法1調(diào)整%B，使0.5<K<20，〔氰基柱、己烷-丙醇做流動相〕2檢查峰拖尾現(xiàn)象3如必要，調(diào)整選擇性a微調(diào)%Bb改變有機溶劑種類〔MC、MTBE、ACN〕微調(diào)%Bc混合有機溶劑d改變柱類型〔二醇、氨基、硅膠〕；微調(diào)%B4優(yōu)化色譜柱條件〔柱長、顆粒大小、流速〕6-7-1-1色譜柱的選擇氰基柱通常是NPC別離的最正確首選；硅膠柱可能更適合于異構(gòu)體別離或疏水組分的制備。與氰基柱相比，硅膠柱的優(yōu)點是：α值較大；二醇柱和氨基柱欠穩(wěn)定，在用氰基柱別離重疊譜峰不成功時才采用〔見6-7-3節(jié)〕。開始以25×0.46cm尺寸柱較好。圖6-27水-有機流動相的正相別離〔a〕25×0.46cm氨基柱，75%ACN-水流動相，1.0ml/min，400C；化合物：1果糖，2葡萄糖，3蔗糖，4麥芽糖；〔b〕條件同〔a〕，但65%ACN-水；化合物：不同聚合數(shù)的低聚糖；各色譜圖中所指的G為葡萄糖、M麥芽糖；〔c〕冠醚樣品〔DB18C6〕在不同RPC柱上的logk與%MeOH的關系圖。如果采用硅膠〔或氧化鋁〕柱進行分析型別離，各運行之間的保存值會發(fā)生變化，需要采取特殊的預防措施〔6-7-4-2節(jié)〕。采用新制備的、弱酸性的B-型硅膠〔見5-2-1-1節(jié)〕對有些樣品的別離很有利。酸性較強的A型硅膠和酸性較弱B型硅膠潛在的性能差異見圖6-29。采用A型硅膠柱時，苯胺〔峰2〕在苯酚〔峰3〕之后流出，峰拖尾嚴重。相反，采用高純度的B型硅膠柱時，苯胺在苯酚之前流出，并且峰形對稱。6-7-1-2流動相溶劑表6-11中總結(jié)了A-溶劑和B-溶劑的可能選擇。如果需在<225nm波長檢測，最正確選擇為己烷〔A〕和丙醇〔B〕。己烷-丙醇流動相還可以提供較大范圍的溶劑強度，尤其采用氰基或其它極性鍵合相柱時。因此，該系統(tǒng)可有效地別離極性差異較大的樣品。圖6-28衍生低聚糖混合物在HILIC柱上的正相別離色譜圖中數(shù)字代表各化合物的聚合數(shù)。條件：20×0.46cmPolyHydroxyethylA柱〔PolyLC公司〕，流動相：乙腈-水〔%ACN見圖示〕；2ml/min；室溫。1，1，2-三氟三氯乙烷〔FC113〕也可用作NPC中的A-溶劑。在低波長的吸收比己烷強，所以UV檢測限于235nm以上。與己烷相比，F(xiàn)C-113溶解樣品更好，且可以與表6-11中所有B-溶劑混溶；從而可極大方便實驗。但是，F(xiàn)C113屬破壞臭氧的化合物，將會逐漸被限用。所以FC113僅在其對于某一特定別離具有明顯的優(yōu)勢時才會考慮，尤其是制備別離。6-7-2調(diào)整保存值對于等度別離，下一步是調(diào)整丙醇濃度使樣品在氰基柱上到達0.5<K<20。先采用100%丙醇，然后按照2倍步長降低丙醇含量〔%B〕：50%，25%，12%，6%，3%，依次類推，假設α隨%B變化〔如圖6-22所示〕，可以進一步調(diào)整%B值以獲得理想的K值范圍、最大α值和別離度。對于硅膠柱，丙醇作為B溶劑可能太強，這時可以采用極性較弱的溶劑如二氯乙烷〔MC〕〔見表6-8〕。與RPC別離類似，可以采用0→100%丙醇-己烷的初始梯度來代替遞減%B的等度過程〔見8-2-2節(jié)〕。通過初始的梯度洗脫實驗，可以決定等度與梯度哪一種更好，并且可以估計出等度別離的最正確%B。圖6-29NPC別離中硅膠柱的差異〔a〕酸性A型硅膠；〔b〕假設酸性B型硅膠。條件：15×0.46cm硅膠柱，0.05%甲醇-二氯甲烷，1.0ml/min；樣品：1甲苯；2苯胺；3苯酚；4苯乙醇；Ⅰ雜質(zhì)。表6-11正相HPLC色譜方法建立的初始條件參數(shù)說明柱尺寸與流速25×0.46cm，5μm柱較好；2~4ml/min柱類型氰基分析方法的最正確選擇，柱穩(wěn)定性好，操作方便。硅膠制備別離的最正確選擇，尤其對有機溶性樣品，可獲得最大α，但分析應用時需控制流動相中水含量〔不方便〕。二醇可替代氰基柱以改變α值，但不夠穩(wěn)