生化實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)資料

名詞解釋凝膠等電聚焦電泳：在電場(chǎng)作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動(dòng)，形成PH梯度蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其PI的PH處，即不再泳動(dòng)而聚焦成帶。離子交換層析：簡(jiǎn)稱為IEC是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組別離子及交換劑上的平衡離子進(jìn)展可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差異而進(jìn)展別離的一種層析方法。SDS：SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其及蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有一樣密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開。透析及超濾:透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)與其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽單糖等分開。超濾是利用壓力、抽濾或離心力等多種形式，強(qiáng)行使水與其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以到達(dá)濃縮與脫鹽目的。親與層析:親與層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親與力而使生物分子別離純化的層析技術(shù)。吸附層析:以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度與在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同程度地被溶解〔解吸〕，然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。凝膠過濾:凝膠層析，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量不同而到達(dá)物質(zhì)別離的一種層析技術(shù)。Rf值：溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率Rf=a/b式中a：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動(dòng)距離b：溶劑前沿移動(dòng)的距離分配系數(shù):K=固定相中溶質(zhì)的濃度/流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解到達(dá)平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值問答題問答題1、 、、與9.0蛋白質(zhì)混合液的方案，并簡(jiǎn)述理由。答:先用PH為6。8的緩沖液平衡陰性離子交換劑，再用這種緩沖液來洗脫蛋白質(zhì)，那么等電點(diǎn)為4。0與6。0的蛋白質(zhì)會(huì)被離子交換劑吸附，等電點(diǎn)為7。5與9。0的蛋白質(zhì)就會(huì)被洗脫下來。再用離子強(qiáng)度小的洗脫液來洗脫，使等電點(diǎn)為6。0的蛋白質(zhì)被洗脫下來，再增大洗脫液的離子強(qiáng)度使等電點(diǎn)為4。0的蛋白質(zhì)也被洗脫下來。別離等電點(diǎn)為7。5與9。0的蛋白質(zhì)：用PH為8。0的緩沖液來平衡陰性離子交換劑，再用這種緩沖液來洗脫蛋白質(zhì)，那么等電點(diǎn)為7。5的蛋白質(zhì)會(huì)被離子交換劑吸附，等電點(diǎn)為9。0的就會(huì)被洗脫下來，再用離子強(qiáng)度小的洗脫液把等電點(diǎn)為7。5的蛋白質(zhì)洗下來。2、 試述柱層析時(shí)柱的安裝、上樣方法以及考前須知。濕裝法系先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時(shí)翻開柱下端口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。這種裝柱法對(duì)各種基質(zhì)都適用。裝好的層析柱應(yīng)立即及洗脫劑連接，在一定的操作壓下（貯液器內(nèi)液面及層析柱出口之間的壓力差），控制其流速，讓2-3倍柱體積的洗脫劑流過固定相，使其到達(dá)平衡，也使固定相高度恒定或第2頁離子強(qiáng)度及洗脫劑一致。此時(shí)層析柱中基質(zhì)應(yīng)符合填裝均勻、松緊一致與沒有氣泡的標(biāo)準(zhǔn)。參加樣品液的體積一般應(yīng)小于床體積的1/2。待樣品液的液面流到固定相外表時(shí)，用滴管參加洗脫劑（其體積用液面距固定相外表的高度約5厘米計(jì)），并在柱上端及裝有洗脫劑的貯液瓶連接開場(chǎng)冼脫?？记绊氈簽榱双@得滿意的別離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當(dāng)控制。如果太快洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會(huì)擴(kuò)散。假設(shè)峰及峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的強(qiáng)度，假設(shè)峰間距離過大，或某些成分不能洗脫時(shí)宜加大洗脫劑的強(qiáng)度（極性），成分復(fù)雜時(shí)，可采用洗脫劑由弱到強(qiáng)的梯度洗脫（方法見離子交換層析）。由層析柱別離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)展純度測(cè)定。如雜質(zhì)含量仍大時(shí)，應(yīng)該用其它方法繼續(xù)純化。3、試述離子交換劑及緩沖液的選擇。答：離子交換劑的選擇：（1）.陰、陽離子交換劑的選擇如果被別離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被別離物質(zhì)帶負(fù)電荷，那么應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被別離物質(zhì)為兩性離子，要按照其穩(wěn)定狀態(tài)的凈電荷來選擇交換劑。假設(shè)一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5，假設(shè)該物質(zhì)在pH5-8穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)選擇陰離子交換劑；假設(shè)該物質(zhì)在pH5以下穩(wěn)定時(shí)，那么可選擇陽離子交換劑。（2.）強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇一般來說，強(qiáng)離子交換劑適用的pH范圍很廣。所以常用它來制備無離子水與別離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。而弱性離子交換劑適用的pH范圍較窄，在pH為中性的溶液中交換容量也高，用于別離生物大分子物質(zhì)時(shí)，其活性不易喪失。所以，別離生物樣品多采用弱離子交換劑。.反離子的選擇離子交換劑處于電中性時(shí)往往帶有一定的反離子。陽離子交換劑的反離子H+(H型)、Na+〔Na型〕與NH+。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。所此，強(qiáng)陽性與強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型與OH型；弱酸性與弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型與Cl型。.基質(zhì)的選擇樹脂基質(zhì)是疏水性化合物，而纖維素、葡聚糖與瓊脂糖基質(zhì)那么是親水性化合物。在別離生物大分子時(shí)，親水性基質(zhì)交換容量高，且對(duì)生物大分子物質(zhì)的吸附與洗脫都比擬溫與，被別離物質(zhì)活性不易受到破壞。緩沖液的選擇：⑴、緩沖液的pH與離子強(qiáng)度直接影響別離物的交換容量離子交換劑不僅可以及被別離物進(jìn)展交換，而且還可以及緩沖液中的離子進(jìn)展交換。因此，離子交換劑吸附被別離物的量及緩沖液的pH值與離子濃度有密切關(guān)系。、起始緩沖液的pH與離子強(qiáng)度應(yīng)有利于樣品中的有效成分及離子交換劑結(jié)合，而雜質(zhì)不能結(jié)合。離子強(qiáng)度以為宜。

用陰離子交換劑時(shí)緩沖液pH值比有效成分的pl值高一個(gè)單位用陽離子交換劑時(shí)緩沖液pH值比有效成分的pl值低一個(gè)單位或者選擇起始緩沖液的離子強(qiáng)度與pH值,使有效成分及離子交換劑結(jié)合得不結(jié)實(shí)，而雜質(zhì)及離子交換劑結(jié)合得牢固，也能得到高純度有效成分。、洗脫液：其離子強(qiáng)度與pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高，pH值要按離子交換劑性質(zhì)來選擇。離子強(qiáng)度/陽離子交換劑/pH 〔逐漸接近pI〕陰離子交換劑\、緩沖液選擇的關(guān)鍵在于了解有效成分的等電點(diǎn)，而未知樣品那么需通過試驗(yàn)來確定4、離子交換劑由哪幾局部組成？何為陽離子交換劑與陰離子交換劑？答：離子交換劑由三局部組成：基質(zhì)+電荷基團(tuán)+反離子?；|(zhì)及電荷基因以共價(jià)鍵連接，電荷基因及反離子以離子鍵結(jié)合．陽離子交換劑：電荷基團(tuán)帶負(fù)電,反離子帶正電荷，可以及溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)展交換反響。陰離子交換劑：陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔-NHCH3〕與伯胺〔-NH2〕基團(tuán)構(gòu)成的。5、5、簡(jiǎn)述生物大分子別離純化的一般步驟與原那么。答：一般步驟：生物組織--提取液--粗產(chǎn)品-〔層析法、電泳法、超離心法、透析與超濾〕—結(jié)晶;根本原那么：防止生物分子變性、降解)控制適當(dāng)?shù)膒H2．)控制低溫3．)注意提取過程中的溶液環(huán)境4)．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基6、簡(jiǎn)述鹽析法別離蛋白質(zhì)的原理。欲提高鹽析效率應(yīng)采取什么措施？答：鹽析法別離蛋白質(zhì)的原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子外表電荷逐漸被中與，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。不同蛋白質(zhì)因所帶電荷與水化程度不同，而在不同的鹽濃度下分別沉淀出來。措施：7、在提取核酸時(shí)，溶液中的蛋白質(zhì)與多糖類物質(zhì)如何除去？7、答：除去溶液中的蛋白質(zhì)主要采用參加去污劑、有機(jī)溶劑與蛋白水解酶等試劑來實(shí)現(xiàn)；混雜于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨〔CTAB〕可到達(dá)別離目的?；蛴玫润w積的2.5mol/L磷酸緩沖液與等體積的乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存在上層乙二醇甲醚中。8、 凝膠等電聚焦電泳時(shí)你如何判斷聚焦的完成及否，通常有哪些因素會(huì)影響聚焦效果。答：當(dāng)電流很小或者為零的時(shí)候聚焦完成；影響因素：兩性電解質(zhì)的質(zhì)量，濃度離子強(qiáng)度，兩性電解質(zhì)PH的范圍。9、 影響紙層析Rf值的主要因素有哪些？主要展開方式？答：1、物質(zhì)的構(gòu)造與極性2、濾紙 ；主要展開方式：下行法、上行法、環(huán)行法、雙向展開法。填空題1、 各類凝膠的一般性質(zhì)是：交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水量或膨脹度越 小。2、 離子交換劑的固相包括：基質(zhì)、 電苛基團(tuán)、反離子。3、 離子交換劑的常用基質(zhì)有：瓊脂糖、纖維素。4、 在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，灌膠前常常要在真空枯燥器中抽氣，灌膠后在膠面上復(fù)蓋約3mm厚的水層，這是因?yàn)榉乐箽馀莓a(chǎn)生與把凝膠壓平 。5、 凝膠等電聚焦電泳時(shí)，從陽極到陰極的pH變化是二步上宜，蛋白質(zhì)在此系統(tǒng)中的聚焦原理是各種蛋白質(zhì)由不同的氨基酸以不同的比例組成，因而有不同的pl。6、 分子篩層析〔凝膠過濾〕的主要用途有測(cè)定分子量、脫鹽與濃縮、別離提純生物大分子、與除去熱原物質(zhì)。7、 用離子交換劑進(jìn)展層析，要把結(jié)合上的蛋白質(zhì)洗脫下來，當(dāng)用陽離子交換劑時(shí)，洗脫液的pH值應(yīng)從到高遞增；當(dāng)用陰離子交換劑時(shí)，pH值應(yīng)從高到低遞增。10、層析法中的分段洗脫法就是：按照逆增洗脫能力順序排列，及幾種洗脫液進(jìn)展逐級(jí)洗脫，梯度洗脫法就是:它洗脫能力是逐步連續(xù)增加，梯度可以指濃度、極性強(qiáng)度或PH值 。11、 凝膠過濾層析常用的基質(zhì)是葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠12、 不連續(xù)PAGE有三種效應(yīng)電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)13、 在雙相電泳系統(tǒng)中，第一相電泳是PAGE等電_PAGE等電點(diǎn)聚焦〔IEF〕_、第二相電泳是SDS。14、 在溶液中保護(hù)生物大分子免受氧化的常用抗氧化劑有：半胱氨酸、維C與二硫蘇糖醇。15、 陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶電，用來別離帶陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶電，反離子帶電荷物質(zhì)；陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，反離子帶負(fù)電，用來別離帶負(fù)電荷物質(zhì)。16、 含25%硫酸銨飽與度的細(xì)胞色素C溶液150ml,需加45克硫酸銨或100ml飽與硫酸銨溶液，才能使其達(dá)55%飽與度。17