《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病原抗體液相芯片法定性分析》

1DBXX/XXXXX—2021實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體液相芯片法定性分析本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體的液相芯片定性分析方法。本文件適用于基于液相芯片方法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體的定性分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適合于本文件。3.1液相芯片技術(shù)suspensionarraytechnology液相芯片技術(shù)是基于編碼微球和流式技術(shù)的一種臨床應(yīng)用型的高通量發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，又被稱為流式熒光術(shù)、懸浮陣列及xMAP技術(shù)等。它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過(guò)紅、綠兩束激光分別識(shí)別微球編碼和報(bào)告熒光來(lái)達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量多分子分析技術(shù)平臺(tái)。3.2多重免疫熒光抗體檢測(cè)MFIA在xMAP技術(shù)平臺(tái)上建立的高通量抗體檢測(cè)方法。通過(guò)將已知抗原偶聯(lián)到不同編碼熒光微球上，待測(cè)物中的特異性抗體與熒光微球抗原發(fā)生特異性結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的二抗熒光報(bào)告分子結(jié)合，最后通過(guò)熒光檢測(cè)儀自動(dòng)讀取報(bào)告熒光和微球熒光編碼，實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)體系中監(jiān)測(cè)多個(gè)靶抗體的目的。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BSA牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）2CPE細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect）EDC碳酰二亞胺（ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride）ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay）MFI中位熒光強(qiáng)度值（medianfluorescenceintensity）MFIA多重免疫熒光試驗(yàn)（multiplexedfluorometricimmunoassay）PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）SA-PE鏈霉親和素-藻紅蛋白（streptavidin-R-phycoerythrin）SPF無(wú)特定病原體（specificpathogenfree）Sulfo-NHS硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimidesodiumsalt）xMAP多分子分析技術(shù)（flexiblemulti-analyteprofilingtechnology）5原理液相芯片技術(shù)又稱為微球懸浮點(diǎn)陣技術(shù)、流式熒光術(shù)、xMAP技術(shù)等，該方法以熒光微球作為反應(yīng)載體，從而可在液相實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的高通量分析。其技術(shù)原理為將直徑為5.6μM的聚苯乙烯小球用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，通過(guò)調(diào)節(jié)兩種熒光染料的不同配比獲得最多可達(dá)100種具有不同特征熒光譜的微球，然后將每種編碼微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的抗原、抗體或核酸探針等捕獲分子。加入待檢樣本后，在液相條件下，靶分子與微球表面交聯(lián)的捕獲分子發(fā)生特異性結(jié)合，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以同時(shí)完成多達(dá)100種的不同反應(yīng)。最后,微球隨液流排成單列傳送至液相芯片檢測(cè)儀進(jìn)行自動(dòng)分析，分析儀通過(guò)紅、綠兩束激光，其中635nm/10mW的紅色二極管激光激發(fā)微球中的分類熒光染料，確定被測(cè)物的特異性（定性532nm/13mW的釔鋁石榴石激光（YAC）激發(fā)結(jié)合在微球表面的報(bào)告熒光素（如藻紅蛋白、Alexa532、Cy3等確定被測(cè)物的量（定量從而完成對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)、定性和定量分析。6主要設(shè)備和材料6.1液相芯片檢測(cè)儀。6.2高速離心機(jī)。6.3藥品保存冰箱（4℃)。6.4超低溫冰箱（-80℃)。6.5漩渦振蕩器。6.6離心管磁力架。6.796孔板磁力架。6.896孔板水平振蕩器。6.9超聲波清洗器。6.10真空抽濾裝置。6.1196孔細(xì)胞培養(yǎng)板。6.12蛋白低吸附離心管（1.5mL）。6.13微量移液器：0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。7試劑7.1抗原7.1.1天然抗原3DBXX/XXXXX—20217.1.1.1特異性抗原：將病毒接種至敏感細(xì)胞培養(yǎng)增殖（見(jiàn)附錄A中的附表A.1），當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)+++～++++時(shí)收獲，凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液經(jīng)超速離心濃縮，再進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，收集純化抗原蛋白帶，制成檢測(cè)抗原。7.1.1.2細(xì)胞對(duì)照抗原：未接種病毒的相應(yīng)細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。7.1.2重組抗原7.1.2.1特異性重組抗原：選取免疫原性較好的抗原片段通過(guò)基因克隆表達(dá)及純化獲得重組抗原（見(jiàn)附錄A中的附表A.2），加入蛋白保護(hù)劑，分裝保存于-80℃超低溫冰箱待用。7.1.2.2表達(dá)系統(tǒng)對(duì)照抗原：將選用的表達(dá)系統(tǒng)按照同等誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)空載體蛋白表達(dá)，收獲空載體誘導(dǎo)菌，超聲裂解，離心取裂解上清作為表達(dá)系統(tǒng)對(duì)照抗原。7.2二抗二抗應(yīng)選用以下兩種之一：a)生物素標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴IgG抗體。用于檢測(cè)相應(yīng)動(dòng)物血清抗體；b)藻紅素偶聯(lián)的生物素標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴IgG抗體。用于檢測(cè)相應(yīng)動(dòng)物血清抗體。7.3SA-PE鏈霉親和素-藻紅蛋白SA-PE7.4熒光微球表面帶有羧基的特定編碼熒光微球MagPlexMicrospheres。7.5磁珠偶聯(lián)試劑硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）碳酰二亞胺（EDC）激活緩沖液（Activationbuffer）：0.1MNaH2PO4，pH6.2偶聯(lián)緩沖液（Couplingbuffer）：50mMMES，pH5.0儲(chǔ)存緩沖液（PBS–TBNbufferPBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Sodiumazide7.6xMAP反應(yīng)液磷酸鹽緩沖液（PBS138mMNaCl，2.7mMKCl，pH7.4反應(yīng)液/洗液（Assay/Washbuffer）：PBS，1%BSA，pH7.47.7對(duì)照血清7.7.1陽(yáng)性血清用特異抗原免疫SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通級(jí)兔、犬、猴所獲得的抗血清；或自然感染恢復(fù)后的犬、猴血清。7.7.2陰性血清4SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清；或確認(rèn)無(wú)相應(yīng)病原感染的兔、犬、猴血清。注：以上所用的試劑除特別注明者外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水或去離子水，應(yīng)符合GB/T6682所規(guī)定一級(jí)水8方法8.1樣品前處理：無(wú)菌采集動(dòng)物血液約0.1mL～0.5mL，37℃放置1h，或者4℃冰箱放置過(guò)夜，5000g離心5min，分離上清待用。8.2磁珠活化8.2.1渦旋和超聲各20s懸浮磁珠，轉(zhuǎn)移5.0×106磁珠到1.5mL低吸附離心管中，記錄磁珠編碼。8.2.2置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.2.3置于磁力架上小心吸去上清，加入100μL雙蒸水，于旋渦震蕩器上震蕩，再用40khz超聲波儀處理20s，使微球充分分散。8.2.4再次置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.2.5置于磁力架上小心吸去上清，加入80μL激活緩沖液；渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.2.610μL50mg/mL硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）加入混懸的磁珠中。8.2.7取10μL50mg/mL碳酰二亞胺（EDC）加入混懸的磁珠中。8.2.8避光，室溫輕搖孵育20min。8.2.9置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.2.10置于磁力架上小心吸去上清，加入250μL偶聯(lián)緩沖液，渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.2.11置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.2.12重復(fù)第8.2.10、8.2.11條步驟，洗滌磁珠共兩次。8.2.13加入100μL相同濃度的偶聯(lián)緩沖液，渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.3抗原偶聯(lián)8.3.1在活化好的懸浮磁珠中加入最適濃度的檢測(cè)抗原，記錄不同檢測(cè)抗原各自對(duì)應(yīng)的熒光編碼。8.3.2加入偶聯(lián)緩沖液體，補(bǔ)齊至終體積500μL。8.3.3渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.3.4避光室溫振蕩混勻孵育2h。8.3.5置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.3.6置于磁力架上小心吸去上清，加入500μLPBS-TBN，渦旋和超聲各20s懸浮磁珠，避光室溫振蕩混勻孵育30min。8.3.7置于磁力架上吸附3min，或12000g離心3min，沉淀磁珠。8.3.8置于磁力架上小心吸去上清，加入1000μLPBS-TBN，渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.3.9重復(fù)第8.3.7、8.3.8條步驟，洗滌磁珠兩次。8.3.10置于磁力架上小心吸去上清，加入250μL～1000μL磁珠儲(chǔ)存液PBS-TBN，渦旋和超聲各20s懸浮磁珠。8.3.11微球計(jì)數(shù)：吸取適量標(biāo)記磁珠，用PBS10倍稀釋后，血球計(jì)數(shù)板在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)公式：每個(gè)大格數(shù)×104×稀釋倍數(shù)×體積（mL），計(jì)算磁珠數(shù)量。8.3.122℃~8℃低溫避光保存偶聯(lián)好的熒光微球抗原待用。5DBXX/XXXXX—20218.4xMAP免疫反應(yīng)8.4.1所有試劑恢復(fù)到室溫，所有的操作均應(yīng)避光，可選用不透明離心管或用鋁鉑膜包裹遮光的離心管進(jìn)行操作。8.4.2稀釋待檢血清：用血清稀釋液將樣本稀釋50倍。8.4.3取出偶聯(lián)好的熒光微球抗原，于旋渦震蕩器上震蕩，再用40khz超聲波儀處理20s，使磁珠充分分散。8.4.4熒光微球工作液的制備：按照所需檢測(cè)的病原項(xiàng)目混合偶聯(lián)抗原熒光磁珠，同時(shí)加入正?？乖瓕?duì)照磁珠。每個(gè)樣品孔需加入檢測(cè)磁珠2500個(gè)/種，用xMAP反應(yīng)液PBS-1%BSA將熒光微球抗原稀釋至終濃度為每種磁珠50個(gè)/μL，于旋渦震蕩器上震蕩30s，再用40khz超聲波儀處理30s，使磁珠充分混勻。8.4.5每個(gè)樣品反應(yīng)孔加入50μL混合好的熒光微球抗原。8.4.6每孔加入50μL稀釋好的待檢樣本。8.4.7避光，室溫，400r/m水平震蕩孵育60min。8.4.8孵育結(jié)束，將96孔反應(yīng)板置于96孔磁力板上吸附3min，棄去上清。8.4.9每孔加入100μLPBS-1%BSA，置于96孔磁力板上吸附3min，棄去上清。8.4.10重復(fù)第8.4.9條步驟，洗磁珠兩次。8.4.11每孔加入100μL生物素標(biāo)記的二抗或PE標(biāo)記二抗，終濃度為1μg/μL～4μg/μL。8.4.12避光，室溫，400r/m水平震蕩孵育60min。8.4.13重復(fù)第8.3.9條步驟，洗磁珠兩次。8.4.14加入SA-PE：PBS-1%BSA稀釋SA-PE至10μg/mL～12μg/mL，每孔加入100μL（PE二抗此步可省略）。8.4.15避光，室溫，400r/min水平震蕩孵育30min。8.4.16重復(fù)第8.3.9條步驟，洗磁珠兩次。8.4.17每孔加入100μLPBS-1%BSA，400r/min水平震蕩2min。8.5液相芯片檢測(cè)儀讀取熒光8.5.1在SA-PE孵育時(shí)，打開(kāi)液相芯片所有相關(guān)儀器，儀器開(kāi)機(jī)預(yù)熱30min。8.5.2按照液相芯片檢測(cè)儀操作說(shuō)明書，進(jìn)行各個(gè)參數(shù)的設(shè)置。8.5.3每個(gè)樣品上機(jī)時(shí)，應(yīng)同時(shí)選擇特定編碼微球，并填寫每種熒光微球?qū)?yīng)病原微生物名稱。8.5.4上樣體積為75μL，流速為快速，每種熒光微球設(shè)置計(jì)數(shù)為至少50個(gè)，計(jì)數(shù)時(shí)間為60s。8.5.5將準(zhǔn)備好的待檢樣本放入液相芯片檢測(cè)儀，并在軟件界面進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)注，開(kāi)啟檢測(cè)。8.5.6反應(yīng)結(jié)束，導(dǎo)出結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行判讀。9結(jié)果9.1數(shù)據(jù)有效性分析每種特定編碼微球個(gè)數(shù)不少于35個(gè)，空白對(duì)照熒光強(qiáng)度中位值（MFI）不高于100，陰性對(duì)照血清MFI值不高于500，陽(yáng)性對(duì)照血清MFI值高于空白對(duì)照五倍以上。9.2閾值(Cutoff)確定6選取至少100份陰性動(dòng)物血清（每個(gè)樣品平行重復(fù)2次分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation，SD）。根據(jù)Cutoff值公式：陰性樣本平均MFI值±3SD，確定為該項(xiàng)目檢測(cè)判定閾值（cutoff值）。9.3結(jié)果分析與定性判定9.3.1在陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照成立的條件下，進(jìn)行結(jié)果判定。9.3.2