仿生超細(xì)有序纖維的設(shè)計制備及其在結(jié)構(gòu)特異組織再生中的應(yīng)用

仿生超細(xì)有序纖維的設(shè)計制備及其在結(jié)構(gòu)特異組織再生中的應(yīng)用近十年來,通過電紡絲(Electrospinning)技術(shù)制備的能仿生組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中纖維組分的納-微米級細(xì)度的超細(xì)纖維,已在組織工程與再生醫(yī)學(xué)(TERM)領(lǐng)域引起極大興趣。但傳統(tǒng)電紡絲方法中射流的不穩(wěn)定鞭動對制備取向性超細(xì)纖維,以用于構(gòu)建人體組織中纖維呈規(guī)整排列的結(jié)構(gòu)特異性組織(如血管、骨、肌腱等)是一個挑戰(zhàn),這不利于在分子、細(xì)胞及組織等多層次上精準(zhǔn)探究仿生纖維支架的組成-結(jié)構(gòu)-性能等因素對細(xì)胞功能的調(diào)控作用、作用機(jī)理及組織再生功效。通過調(diào)控紡絲液的粘彈性,我們之前發(fā)展了一種可制備高度取向的超細(xì)纖維制備方法?穩(wěn)定射流電紡絲(SJES)法,這不僅會有助于解決電紡纖維在TERM應(yīng)用中存在的一些關(guān)鍵問題(如細(xì)胞長入問題),更為高仿生化構(gòu)建結(jié)構(gòu)特異性組織提供了較好的研究平臺。本研究基于SJES法制備的高度取向超細(xì)纖維,主要是經(jīng)不同層次的結(jié)構(gòu)設(shè)計、生物活性成分修飾和力學(xué)性能(剛度調(diào)控)處理后,依次探討這些仿生有序纖維對解決傳統(tǒng)電紡纖維支架存在的細(xì)胞3D長入問題,對調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞(vSMCs)的收縮型表型發(fā)展和血管再生功效,以及對人源間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的成骨分化、成肌腱分化的影響及作用機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下:(1)采用SJES法和傳統(tǒng)平行電極法(PES)制備了不同取向特征的左旋聚乳酸(PLLA)取向纖維,通過對纖維形貌(SEM)、熱學(xué)(DSC)、結(jié)晶(XRD)、分子取向(P-FTIR、WAXD)、力學(xué)性能等的表征,系統(tǒng)地比較了這兩種方法制備的取向纖維的性能差異。結(jié)果表明,SJES法相比PES法制備的取向纖維,不僅纖維的取向度高,而且具有更高的分子取向度及力學(xué)性能,滿足用于構(gòu)建結(jié)構(gòu)特異性組織時對纖維取向度和力學(xué)性能的要求。(2)針對傳統(tǒng)電紡絲方法制備的纖維支架不利于細(xì)胞的3D長入問題,我們利用SJES法結(jié)合X-Y平臺技術(shù)打印制備了纖維直徑在2?m左右的、孔徑可調(diào)的、結(jié)構(gòu)規(guī)整的、沉積厚度可控的三維PLLA超細(xì)纖維支架。重點(diǎn)研究了工藝參數(shù)(如:X-Y平臺移動速度、注射速率、接收距離等)對構(gòu)建3D有序大孔支架的影響。制備的3D有序大孔纖維支架可以促進(jìn)模型細(xì)胞vSMCs的黏附、鋪展、沿著纖維方向生長、增殖以及長入支架內(nèi)部。該工作說明基于SJES的仿生超細(xì)有序纖維3D沉積技術(shù)在解決傳統(tǒng)電紡纖維支架存在的細(xì)胞3D長入問題方面有較好的可行性,可以用于3D組織的仿生構(gòu)建。(3)利用SJES制備了具有殼芯結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸(HA,殼層)/聚乳酸(PLLA,芯層)取向納米纖維,研究了HA的纖維表面涂層修飾對調(diào)控vSMCs向收縮表型發(fā)展的促進(jìn)作用。體外評價結(jié)果表明,經(jīng)HA功能化的PLLA取向納米纖維可顯著促進(jìn)vSMCs的取向生長、增殖、及肌動蛋白(?-SMA)、肌球蛋白重鏈(SM-MHC)、彈性蛋白(Elastin)的表達(dá)。將HA/PLLA纖維制成周向取向管狀支架(直徑3mm,仿生天然血管的中層結(jié)構(gòu))移植到兔頸動脈缺損6周后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,?-SMA陽性細(xì)胞(vSMCs)沿著支架內(nèi)壁周向生長,在HA/PLLA血管支架表面有內(nèi)皮層形成,且在支架內(nèi)部有毛細(xì)血管生成。這些結(jié)果說明用高度取向的HA/PLLA纖維通過僅僅構(gòu)建血管的平滑肌層結(jié)構(gòu)就能調(diào)控和增強(qiáng)vSMCs向正常的收縮型表型發(fā)展和血管再生,這為提高組織工程血管的再生功效提供了新的思路和方法。(4)通過退火處理改變SJES法制備的PLLA取向纖維的剛度,研究了纖維剛度變化對hMSCs的分化影響及機(jī)制。結(jié)果表明:高纖維剛度有利于促進(jìn)hMSCs的取向生長、增殖;能夠促進(jìn)成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達(dá)而降低肌腱分化特異性轉(zhuǎn)錄因子scleraxis(SCX)的表達(dá),且有利于hMSCs的成骨分化;高纖維剛度有利于AKT(Serine/threonineKinase,AKT)的活化、YAP(Yes-associatedprotein)及YAP相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ANKRD1,CTGF)的表達(dá);而抑制AKT的活化,則顯著降低YAP及RUNX2的表達(dá);有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)高纖維剛度有利于巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)的表達(dá),而抑制MIF,則顯著抑制AKT的磷酸化;因此揭示了纖維剛度誘導(dǎo)hMSCs成骨分化是通過MIF介導(dǎo)的AKT/YAP/RUNX2信號通路的作用機(jī)理。(5)制備了采用肌腱ECM主要成分修飾的仿生取向纖維,體外研究了該功能化仿生纖維對hMSCs成肌腱分化的影響。也就是,通過SJES法制備了經(jīng)肌腱ECM主要成分I型膠原(COL1)和硫酸軟骨素(CS)修飾的PLLA殼芯超細(xì)取向纖維支架。對hMSCs在PLLA,COL1(殼)/PLLA(芯)及COL1-CS(殼)/PLLA(芯)纖維支架上的生長進(jìn)行形貌觀察、細(xì)胞增殖及成肌腱分化檢測,結(jié)果表明,COL1-CS(殼)/PLLA(芯)取向纖維能夠促進(jìn)hMSCs的鋪展與增殖,基因水平肌腱相關(guān)基因SCX,TN-C及COL1呈高表達(dá),標(biāo)志性蛋白(TNMD)也表現(xiàn)為高陽性表達(dá)率,證明該仿生纖維支架具有優(yōu)良的成肌腱誘導(dǎo)能力。進(jìn)一步在引入力學(xué)刺激條件下培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)力學(xué)信號可以協(xié)同生物信號誘導(dǎo)hMSCs肌腱分化。而且,我們發(fā)現(xiàn)TGF-?信號相關(guān)分子TGF?2,TGF?3,TGFBRII,Smad3在COL1-CS(殼)/PLLA(芯)纖維支架上高表達(dá),說明COL1-CS(殼)/PLLA(芯)纖維誘導(dǎo)成肌腱分化是通過TGF?/Smad3/SCX信號通路進(jìn)行。綜上所述,本研究采用SJES法制備了力學(xué)性能優(yōu)良的高度取向PLLA仿生超細(xì)纖維可滿足特異性組織工程支架的要求;SJES法結(jié)合X-Y平臺可設(shè)計制備有序超細(xì)3D大孔PLLA纖維支架用于3D組織再生;HA功能化取向PLLA超細(xì)纖維有利于vSMCs的健康表型表達(dá)及血管再生;取向超細(xì)PLLA纖維的剛度通過MIF介導(dǎo)的AKT/YAP/RUNX2信號通路誘導(dǎo)hMSCs成骨分化;COL1-CS功能化取向超細(xì)PLLA纖維可通過TGF?/Smad3/SCX信號通路誘導(dǎo)hMSCs向