分子病毒學(xué)課件

一、病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能

緒論

二、病毒基因表達的調(diào)控原理三、病毒感染的分子機制四、病毒致癌的分子機理五、抗病毒活性物質(zhì)六、病毒基因工程疫苗第一節(jié)分子病毒學(xué)的主要研究內(nèi)容

一、病毒的發(fā)現(xiàn)時期二、病毒的化學(xué)時期1、病毒的結(jié)晶2、電子顯微鏡的應(yīng)用三、病毒研究的細胞水平時期四、分子病毒學(xué)的研究時期

第一節(jié)病毒的定義第二節(jié)病毒的分類和命名一、病毒分類和命名的規(guī)則（一）一般規(guī)則（二）分類階元的命名規(guī)則（三）種的規(guī)則（四）屬的規(guī)則（五）亞科的規(guī)則（六）科的規(guī)則（七）目的規(guī)則（八）亞病毒感染因子的規(guī)則（九）書寫規(guī)則二、病毒分類原理及其依據(jù)（一）病毒分類原理（二）病毒分類的依據(jù)1、病毒粒子特性2、病毒抗原性質(zhì)3、病毒生物學(xué)特性（三）病毒種的概念及其分類依據(jù)（1）基因組序列的相關(guān)性（2）天然的宿主范圍（3）細胞和組織的嗜親性（4）致病和細胞病變特點（5）傳播方式（6）生理生化性質(zhì)（7）抗原特性三、病毒分類系統(tǒng)第三章病毒的結(jié)構(gòu)極其基因組第一節(jié)病毒的結(jié)構(gòu)組成一、病毒的包膜（一）病毒包膜的來源（二）病毒包膜的化學(xué)組成1、病毒包膜所含有的脂類2、病毒包膜糖蛋白（三）病毒包膜的功能1、病毒吸附2、細胞融合活性3、血溶活性4、抗原性二、病毒的衣殼（一）衣殼的組成（二）衣殼蛋白的功能1、保護病毒基因組2、決定病毒的抗原性3、吸附作用4、血凝作用三、病毒的內(nèi)含物第二節(jié)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型一、螺旋對稱的病毒殼體二、二十面體對稱的病毒殼體三、復(fù)合對稱的病毒殼體第三節(jié)病毒的基因組一、病毒的核酸類型二、病毒核酸的大小及其堿基的組成三、病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征（一）DNA病毒基因組1、雙鏈DNA病毒基因組2、單鏈DNA病毒基因組（二）RNA病毒基因組1、正鏈RNA病毒基因組2、負鏈RNA病毒基因組3、雙鏈RNA病毒基因組（三）病毒基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性1、粘性末端2、末端冗余3循環(huán)排列

4、回文結(jié)構(gòu)5、末端反向重復(fù)序列

6、重疊基因7、分段基因組8、帽子和poly（A）結(jié)構(gòu)

9、其他結(jié)構(gòu)特征

第四章病毒的吸附、侵入和脫殼第一節(jié)病毒的吸附一、病毒的吸附蛋白1、細胞受體結(jié)合區(qū)2、融合區(qū)3、跨膜區(qū)4、膜內(nèi)區(qū)二、病毒的細胞受體1、細胞受體單位2、細胞受體位點三、病毒吸附蛋白與細胞受體結(jié)合的機制1、可逆性吸附2、不可逆性吸附3、影響病毒吸附的環(huán)境因素第二節(jié)病毒的侵入一、注射式侵入二、細胞內(nèi)吞三、膜融合四、直接侵入第三節(jié)病毒的脫殼第五章病毒基因組的復(fù)制第一節(jié)病毒基因組復(fù)制的基本特點一、全保留復(fù)制和半保留復(fù)制二、病毒基因組的復(fù)制起始三、病毒基因組的復(fù)制方向四、連續(xù)復(fù)制與不連續(xù)復(fù)制第二節(jié)病毒基因組復(fù)制所需的復(fù)制酶一、依賴于宿主細胞的復(fù)制酶二、病毒基因組自身編碼的復(fù)制酶1、DNA病毒自身編碼的復(fù)制酶及其相關(guān)蛋白2、RNA病毒自身編碼的復(fù)制酶三、病毒蛋白與宿主蛋白構(gòu)成的病毒復(fù)制酶第三節(jié)病毒基因組的復(fù)制與調(diào)控一、病毒基因組復(fù)制的主要方式1、復(fù)制叉方式2、滾環(huán)方式3、鏈置換方式二、dsDNA病毒基因組的復(fù)制1、T4噬菌體基因組DNA的復(fù)制2、腺病毒基因組DNA的復(fù)制3、痘病毒基因組DNA的復(fù)制4、乙型肝炎病毒（HBV）基因組DNA的復(fù)制5、SV40病毒基因組DNA的復(fù)制三、ssDNA病毒基因組的復(fù)制1、自主性細小病毒基因組DNA的復(fù)制2、依賴性細小病毒基因組DNA的復(fù)制四、dsRNA病毒基因組的復(fù)制五、+ssRNA病毒基因組的復(fù)制

1、脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的復(fù)制2、+ssRNA噬菌體基因組的復(fù)制六、-ssRNA病毒基因組的復(fù)制七、病毒基因組DNA復(fù)制的調(diào)控1、174DNA復(fù)制的調(diào)控2、噬菌體DNA復(fù)制的調(diào)控3、SV40DNA復(fù)制的調(diào)控4、腺病毒DNA復(fù)制的調(diào)控

病毒基因病毒包括mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯兩個不同的過程。首先以病毒基因組核酸（DNA或RNA）為膜板，在病毒或宿主特異性RNA聚合酶的作用下，依照堿基配對互補的原則，轉(zhuǎn)錄生成病毒mRNA，然后這些轉(zhuǎn)錄生成的mRNA攜帶病毒的基因信息，進入宿主細胞的核搪體上，再經(jīng)過翻譯，合成病毒蛋白外，還有病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄所需的酶如復(fù)制酶、轉(zhuǎn)錄酶，，以及一種或幾種調(diào)節(jié)蛋白，有包膜的病毒直至合成包膜糖蛋白。第六章病毒的基因表達

由于病毒缺少編碼核糖體的遺傳信息，因而其蛋白質(zhì)翻譯完全依賴宿主的翻譯體系，但病毒RNA通過同宿主細胞核糖體結(jié)合，可以改變宿主核糖體的合成路線，使之合成病毒蛋白而不在合成細胞蛋白。第一節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工一、病毒基因轉(zhuǎn)錄的特點（一）病毒的早期轉(zhuǎn)錄和晚期轉(zhuǎn)錄

病毒基因轉(zhuǎn)錄有先后之分，即按不同時序進行轉(zhuǎn)錄的，這是病毒基因表達的重要特點之一。病毒的早期轉(zhuǎn)錄一般發(fā)生在病毒感染初期，其早期基因主要編碼合成與病毒基因組復(fù)制以及晚期基因表達相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)；而病毒的晚期轉(zhuǎn)錄則出現(xiàn)在病毒基因組復(fù)制之后，其晚期基因主要編碼合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白如衣殼蛋白、包膜糖蛋白等。

腺病毒基因組DNA進入宿主細胞核后，首先啟動早期轉(zhuǎn)錄，然后進行中期和晚期轉(zhuǎn)錄。在腺病毒的dsDNA中，3’-5’鏈稱為γ鏈，轉(zhuǎn)錄方向從左到右；5’-3’鏈稱為l，轉(zhuǎn)錄方向從右到左，早期轉(zhuǎn)錄除了出現(xiàn)在l鏈上外，也出現(xiàn)在γ鏈上，如早期基因區(qū)E1A、E1B和E3在γ鏈上轉(zhuǎn)錄，E2A、E2B和E4在l鏈上轉(zhuǎn)錄；晚期轉(zhuǎn)錄如L1、L2、L3、L4、L5基因區(qū)的轉(zhuǎn)錄均發(fā)生在γ鏈上。1、腺病毒的早期轉(zhuǎn)錄

E3基因區(qū)在76.6~86.2mu之間，其啟動子在76.6mu處，該區(qū)至少轉(zhuǎn)錄6種mRNAs，它們分別編碼14KD、14.7KD、11KD、10KD、16KD和19KD蛋白。雖然E3并非是病毒生長和復(fù)制所必須的，在缺少大部分或全部E3區(qū)的情況下，Ad仍能在組織培養(yǎng)上繁殖，但一些證據(jù)表明，E3區(qū)編碼的19KD糖蛋白能夠結(jié)合位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的MHC多肽的重鏈，并且阻止MHC進一步轉(zhuǎn)移到細胞表面，從而降低細胞毒性T淋巴細胞對Ad感染靶細胞的識別。2、腺病毒的晚期轉(zhuǎn)錄

所謂非對稱性轉(zhuǎn)錄是指病毒基因的轉(zhuǎn)錄并不固定在一條DNA鏈上，其中一些基因從一條鏈上轉(zhuǎn)錄，而另一些基因從另一條鏈上轉(zhuǎn)錄，因而使轉(zhuǎn)錄方向有左向和右向或者順時針和逆時針的區(qū)別。（二）病毒的非對稱性轉(zhuǎn)錄（三）病毒的多基因轉(zhuǎn)錄和單基因轉(zhuǎn)錄

所謂多基因轉(zhuǎn)錄是指多個基因聯(lián)合轉(zhuǎn)錄在一條鏈上，這樣的mRNA也稱為多順反子（polycistroicmRNA）；單基因轉(zhuǎn)錄是指一個基因單獨轉(zhuǎn)錄在一條mRNA鏈上，這樣的mRNA也稱為單順反子mRNA（polycistroicmRNA）。（四）病毒轉(zhuǎn)錄方式的差異

由于病毒基因組具有線狀或環(huán)狀，單鏈或雙鏈，正鏈或負鏈區(qū)分，因而mRNA的轉(zhuǎn)錄方式也各有不同。對于dsDNA病毒來說，它們能以任意一條鏈為模板轉(zhuǎn)錄出mRNA；ssDNA病毒則必需以其單鏈為模板，首先復(fù)制形成另一條鏈子代DNA鏈，再由二者結(jié)合形成dsDNA后，才能從其中任意一條鏈上轉(zhuǎn)錄合成mRNA；對于+ssRNA病毒而言，其基因組+ssRNA或者直接作為mRNA，或者先復(fù)制一條與親本+ssRNA互補的-ssRNA，再以-ssRNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA；然而-ssRNA病毒可以直接以-ssRNA為模板合成mRNA；dsRNA病毒則是以其中的負鏈RNA為模板進行全保留轉(zhuǎn)錄而合成mRNA；逆轉(zhuǎn)錄病毒比較特殊，其+ssRNA基因組在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條cDNA鏈，再以cDNA鏈為模板復(fù)制出另一條DNA鏈，由兩條DNA結(jié)合形成原病毒dsDNA，然后原病毒dsDNA整合到宿主細胞染色體DNA上，以整合的原病毒dsDNA作為模板轉(zhuǎn)錄合成Mrna。

二、病毒基因轉(zhuǎn)錄所需要的轉(zhuǎn)錄酶

（一）病毒利用宿主的RNA聚合酶（二）病毒粒子攜帶的轉(zhuǎn)錄酶（三）病毒在復(fù)制循環(huán)中自身編碼的轉(zhuǎn)錄酶（四）病毒蛋白和宿主蛋白共同構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄酶三、病毒基因的轉(zhuǎn)錄啟動子與轉(zhuǎn)錄起始

一些DNA病毒的基因轉(zhuǎn)錄除了需要RNA聚合酶和適宜的模板外，其基因組DNA上也有類似于原核生物和真核生物的轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點，真核DNA病毒甚至還含有增強子序列，這些特定的調(diào)控元件直接參與了病毒基因轉(zhuǎn)錄的起始和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。真核-ssRNA病毒如副粘病毒、彈狀病毒的基因組雖然沒有轉(zhuǎn)錄啟動子，但其轉(zhuǎn)錄起始與先導(dǎo)序列區(qū)以及基因接頭區(qū)的特定核苷酸序列有關(guān)。（一）DNA噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的啟動子1、-10區(qū)在距離轉(zhuǎn)錄起始位點第一個核甘酸的上游-13~-4位堿基處有一段序列叫做Pribnowbox，即-10區(qū)，典型的Pribnowbox

的保守序列為TARAAT，其中第6個堿基全是T，故稱為保守T，由于-10區(qū)富含AT序列，因而易于變性和解鏈。2、-35區(qū)-35區(qū)位于Pribnowbox左側(cè)，其共同序列為TTGACA。（二）真核DNA病毒基因轉(zhuǎn)錄的啟動子與增強子1、TATAbox真核DNA病毒與真核生物一樣，在基因轉(zhuǎn)錄起始位點的上游有一個保守的啟動子序列，它有TATAA（T）AA（T）組成，稱為~，又叫Hognessbox或Goldberg-Hognessbox，其位置不在-10區(qū)，而在-30區(qū)~-20區(qū)。TATAbox靠近轉(zhuǎn)錄起始位點，主要參與病毒mRNA轉(zhuǎn)錄起始點的選擇，與轉(zhuǎn)錄起始的精確性有關(guān)。如果TATA區(qū)出現(xiàn)堿基缺失或突變，都會對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生嚴重影響，如在腺病毒晚期啟動子TATA區(qū)，出現(xiàn)含有TATA序列的-47~-21區(qū)缺失，其晚期基因完全不能轉(zhuǎn)錄，而且即使G或A替代啟動子TATAbox中的第三個堿基T形成TAGA或TAAA，也會引起基因轉(zhuǎn)錄下降。2、CAATbox和GCbox真核DNA病毒在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-110~-40區(qū)還有另外兩種啟動子序列，一個啟動子序列為GGC（T）CAAT（A），其中CAAT序列相當保守，故稱CAATbox；另一個啟動子序列為CCGCCC或GGCGGG，稱為GCbox。HSVtk基因在TATAbox的上游有一個CAATbox和2個GCbox，HSVa4基因沒有CAATbox，但有5個GCbox。

CAATbox和GCbox雖然不參與轉(zhuǎn)錄起始點的確定，但一些細胞轉(zhuǎn)錄因子如NF1與CAATbox結(jié)合，SP1與GCbox結(jié)合，可以促進RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄，提高病毒基因轉(zhuǎn)錄的效率。3、增強子是指能使與它連鎖的上游或下游基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強的DNA序列。在SV40基因組中首次發(fā)現(xiàn)了增強子，它位于SV40早期基因上游-250~-107bp，含有兩個正向重復(fù)序列，每個長度為72bp，其核心序列為GGTGTGGAAAG。具有如下特點：（1）轉(zhuǎn)錄增強效應(yīng)明顯，增強子一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10~200倍，有的可以增加上千倍。（2）增強效應(yīng)與位置和取向無關(guān)，不論增強子是在基因的上游或下游，均表現(xiàn)出增強效應(yīng)。（3）增強子一般為重復(fù)序列，長度在50bp以上，通過特定的轉(zhuǎn)錄基因與其結(jié)合，可增進轉(zhuǎn)錄作用。（4）增強效應(yīng)有嚴格的組織和細胞特異性，但對其所作用的基因無專一性。（5）有的病毒增強子還受外部信號的調(diào)控，如小鼠乳腺瘤病毒啟動子的上游大約-100bp處，有一個增強子序列，它是固醇類激素與其受體蛋白所形成的復(fù)合物結(jié)合到該增強子序列上之后，不僅能促進下游基因的轉(zhuǎn)錄，而且還能促進上游基因的轉(zhuǎn)錄。4、帽子位點存在于啟動子的下游，它是真核DNA病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點，病毒基因轉(zhuǎn)錄模板鏈上帽子位點的堿基一般為T，這樣mRNA摻入的第一核苷酸就是ATP。（三）病毒的轉(zhuǎn)錄起始

宿主RNA聚合酶或病毒編碼的RNA聚合酶對病毒基因啟動子的識別和特異性結(jié)合，是轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟。就是T4、T7噬菌體的早期轉(zhuǎn)錄而言，細菌RNA聚合酶全酶中的亞基負責識別和尋找早期轉(zhuǎn)錄啟動子，它與RNA聚合酶全酶特異性地結(jié)合這些基因的轉(zhuǎn)錄啟動子，以及進行精確的轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)……顯然核心酶催化的轉(zhuǎn)錄起始是隨機的。四、病毒的轉(zhuǎn)錄終止（一）轉(zhuǎn)錄終止子

目前在噬菌體DNA模板鏈上發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄終止位點，即終止子，這些終止子具有共同的結(jié)構(gòu)特征：其終止子上游存在有反向重復(fù)序列，該序列富含GC堿基對，由此段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA易于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在終止點的下游有一段由48個A組成的序列，因而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端帶有寡聚U，這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄終止，當新生RNA出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致RNA聚合酶暫停，破壞RNA-DNA雜喝鏈的正常結(jié)構(gòu)；而寡聚A的存在又能使雜合鏈中的RNA3’端產(chǎn)生不穩(wěn)定的A：U區(qū)域；結(jié)果二者共同作用導(dǎo)致RNA從DNA模板鏈上解離下來。

轉(zhuǎn)錄終止子有兩種類型：一類是不依賴于蛋白輔助因子，即ρ因子的終止子；另一類是依賴于ρ因子的終止子從圖可知不依賴ρ因子的終止子在結(jié)構(gòu)上除了莖的長度不同外，都有富含GC區(qū)，而且莖-環(huán)結(jié)構(gòu)之后都帶有一個ploy（U）區(qū)；而依賴于ρ因子的終止子既缺少富含GC區(qū)，也無ploy（U）尾。1、不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

2、依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止（二）抗轉(zhuǎn)錄終止作用

五、病毒的轉(zhuǎn)錄后加工和拼接

通常噬菌體mRNA5’端缺少帽子，3’端也無poly（A）尾，其合成的mRNA大多不需要加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄就可以直接翻譯合成病毒蛋白，但某些DNA噬菌體的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多順反子mRNA，需要經(jīng)過核酸內(nèi)切酶切割成較小的片段，才能進行翻譯。真核DNA病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA大都需要在5’端戴帽和3’端加尾，除此而外，轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物還需要先切除內(nèi)含子，再進行拼接，最后才形成成熟的Mrna。（一）病毒mRNA5’端的戴帽

大多數(shù)真核病毒mRNA的5’端都有以5’-5’結(jié)合的7甲基化鳥苷酸殘基封閉的結(jié)構(gòu)，稱為帽子0如果在原mRNA第一個核苷酸2’-O位上繼續(xù)產(chǎn)生甲基化，則形成帽子1，第二個核苷酸2’-O位上甲基化，構(gòu)成帽子2。真核病毒mRNA5’帽子有以下功能（1）帽子結(jié)構(gòu)作為核糖體識別mRNA的信號；（2）帽子結(jié)構(gòu)增加了病毒mRNA的穩(wěn)定性，使之棉遭宿主細胞核酸酶的攻擊。（3）帽子結(jié)構(gòu)能被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識別，從而促進病毒蛋白的合成。（二）病毒mRNA3’端加ploy（A）尾

幾乎所有研究過的動物病毒的mRNA3’端都有ploy（A）尾，長度一般短于真核細胞mRNA3’端的ploy（A）尾。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在ploy（A）位點上游的10~25個核苷酸處都存在有加尾識別信號序列AAUAAA，其內(nèi)切酶能夠識別AAUAAA序列。病毒mRNA的ploy（A）尾主要與其在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性有關(guān)，一般而言，ploy（A）短的mRNA半衰期也短，ploy（A）長的mRNA則半衰期也長。（三）病毒mRNA前體的拼接

在病毒內(nèi)含子兩端也有類似于真核生物結(jié)構(gòu)基因的拼接供體和受體信號，即5’！GU……AG！3’，通過宿主細胞的拼接體系識別該信號，可以促進病毒mRNA前體的拼接。在這里5’GU和3’端AG信號對mRNA前體的拼接是十分重要的。

一些研究還證實內(nèi)含子的內(nèi)部序列也可以影響mRNA前體的拼接效率Khoury曾分離得到SV40早期基因T缺失的突變株，這些缺失發(fā)生在早期基因的內(nèi)含子中，雖然它們并未涉及到拼接信號，但其早期的初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與野生型SV40相比，經(jīng)過切割和拼接產(chǎn)生的成熟mRNA以及翻譯合成T抗原的量都大為減少，究其原因可能是由于宿主拼接酶系的作用還要求mRNA前體有特定的二級或三級空間構(gòu)型的緣故，而維持這種空間構(gòu)型則需要有內(nèi)含子序列的存在。在真核細胞中存在多種豐富的小分子叫做核內(nèi)小RNA（smallnuclearRNA，snRNA），其中參與mRNA前體拼接的主要有U1、U2、U4、U5和U6snRNA，這些snRNA經(jīng)常與核內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)結(jié)合形成核內(nèi)小核糖核蛋白（smallnuclearribonuleoprotein，snRNA），并與mRNA前體共同組成一個拼接體（spliceosome）

從上述可以看出，病毒mRNA前體的拼接既受控于宿主細胞的拼接系統(tǒng)，也需要有病毒自身編碼的調(diào)節(jié)蛋白以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的“拼接RNA”起作用。第二節(jié)病毒蛋白的翻譯及其翻譯后加工

病毒mRNA翻譯合成蛋白質(zhì)的過程是在核糖體上進行的，其核糖體完全由宿主細胞的組分構(gòu)成，沒有任何病毒組分的參與，因此病毒類似于宿主細胞mRNA的翻譯過程，而病毒蛋白產(chǎn)物的翻譯后加工則不盡相同。一、核糖體對病毒mRNA起始密碼子的識別與翻譯起始

真核生物核糖體40S亞基上的18SrRNA3’端雖然沒有原核生物16SrRNA那樣的CUCCA序列，而且真核生物和真核病毒mRNA5’也沒有SD序列，但其mRNA5’端的帽子結(jié)構(gòu)可作為核糖體40S亞基以及起始因子eIF3、eIF4B、eIF4F、eIF4A的識別和結(jié)合信號。一些研究還發(fā)現(xiàn)，真核病毒mRNA除了5’端帽子結(jié)構(gòu)與病毒蛋白合成起始有關(guān)外，在起始密碼子子AUG附近可能亦存在與18rRNA3’末端互補的序列。大多數(shù)噬菌體和真核病毒蛋白翻譯是從mRNA上的起始密碼子AUG起始的，但副粘病毒PORFmRNA上的AUG、GUG和ACG均可作為起始密碼子，翻譯合成不同的蛋白質(zhì)。

二、病毒蛋白的翻譯后加工（一）病毒蛋白前體的切割（二）病毒蛋白的化學(xué)修飾

有些病毒蛋白在宿主細胞核糖體上合成后，需要經(jīng)過切割和共價修飾，即進行翻譯后加工，才能形成成熟而有功能的蛋白質(zhì)，如一些病毒多蛋白前體的切割，糖基化和磷酸化修飾等其修飾作用包括磷酸化、甲基化和脂?；?。1、病毒蛋白的磷酸化

宿主或病毒編碼的蛋白激酶能將ATP末端的磷酸基團轉(zhuǎn)移到病毒蛋白的Ser，Thr和Tyr殘基上，使之形成磷酸化蛋白，磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后廣泛存在的一種化學(xué)修飾，是控制酶活性的重要步驟。2、病毒蛋白的糖基化

一些動物病毒的包膜蛋白在翻譯后產(chǎn)生糖基化，形成糖蛋白突起，它與病毒粒子的吸附和侵入有關(guān)。通常這些寡糖經(jīng)過N-或O-糖基化連接于Asn、Ser和Thr殘基上，糖基化作用往往發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。

干擾素第一節(jié)干擾素基因及其編碼的蛋白質(zhì)一、I型干擾素基因和蛋白產(chǎn)物二、II型干擾素基因和蛋白產(chǎn)物第二節(jié)干擾素的誘導(dǎo)合成一、I型干擾素的合成二、II干擾素的合成第三節(jié)干擾素受體及信號傳遞途徑一、干擾素受體二、干擾素的信號傳遞途徑第四節(jié)干擾素誘導(dǎo)的抗病毒作用一、2-5（A）合成酶和RNaseL途徑二、dsRNA依賴性蛋白激酶途徑三、Mx蛋白的抗抗病毒機制四、其他干擾素誘導(dǎo)蛋白的抗病毒作用第五節(jié)病毒抗干擾素作用的對策第十一章噬菌體分子生物學(xué)第一節(jié)噬菌體的結(jié)構(gòu)組成一、有尾噬菌體的結(jié)構(gòu)（一）殼體組成1.頭部2.尾部

（二）有尾噬菌體的核心1.T偶數(shù)噬菌體核心2.λ噬菌體核心3.其他有尾噬菌體的核心二、球部噬菌體的結(jié)構(gòu)（一）殼體結(jié)構(gòu)（二）球形噬菌體的核心三、絲狀噬菌體的結(jié)構(gòu)第二節(jié)噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)一、DNA噬菌體基因組（一）dsDNA噬菌體基因組1.Λ噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)

2.T4噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)（二）ssDNA噬菌體基因組1.

φX174噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)2.M13噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)二、RNA噬菌體基因組第三節(jié)噬菌體基因組的復(fù)制一、DNA噬菌體基因組的復(fù)制（一）dsDNA噬菌體基因組的復(fù)制1.λ噬菌體DNA復(fù)制2.T7噬菌體DNA復(fù)制（二）ssDNA噬菌體基因組的復(fù)制1.以親代環(huán)狀+ssDNA分子為膜板合成互補的負鏈2.子代+ssDNA的合成二、RNA噬菌體基因組的復(fù)制第四節(jié)噬菌體基因組轉(zhuǎn)錄與翻譯的調(diào)控一、噬菌體基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控1.λ噬菌體的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控2.T7噬菌體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控3.其他噬菌體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控二、噬菌體翻譯的調(diào)控1.反義RNA在λ噬菌體基因Q翻譯中的調(diào)控作用2.R17噬菌體RNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯的調(diào)節(jié)

第五節(jié)噬菌體溶原性感染一、噬菌體溶原化狀態(tài)的建立二、噬菌體基因組的整合三、原噬菌體的割離四、轉(zhuǎn)導(dǎo)1.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)2.局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)第六節(jié)基因克隆的噬菌體載體一、λ載體（一）酶切位點的去除與再建1.EcoRI位點的去除2.λ同類噬菌體的重組3.酶切位點的再建（二）遺傳標記與λ載體的重組（三）Spi重組體的篩選（四）chi位點的引入（五）表達載體的構(gòu)建二、粘粒載體三、M13載體第十二章動物病毒分子生物學(xué)第一節(jié)動物dsDNA病毒一、嗜肝DNA病毒科（一）病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）病毒基因組及其編碼蛋白（三）病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄（四）病毒粒子的組裝與釋放1.20nm空心顆粒的組裝2.Dane顆粒的組裝與釋放（五）嗜肝DNA病毒與肝細胞癌二、痘病毒科（一）病毒粒子的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成（二）病毒基因組極其編碼蛋白（三）病毒粒子所包含的多肽和酶（四）病毒的侵入與脫殼1.病毒的侵入2.病毒粒子的脫殼（五）病毒的基因表達1.早期轉(zhuǎn)錄2.中期轉(zhuǎn)錄3.晚期轉(zhuǎn)錄（六）病毒粒子的組裝與釋放（七）痘苗病毒作為外源基因表達的載體

第二節(jié)動物ssDNA病毒一、細小病毒基因組及其編碼產(chǎn)物二、細小病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄（一）自主細小病毒（二）依賴細小病毒三、AAV作為基因克隆的載體四、AAV與抑癌作用

第三節(jié)動物dsRNA病毒一、呼腸孤病毒粒子的結(jié)構(gòu)二、呼腸孤病毒的基因組三、呼腸孤病毒編碼的蛋白質(zhì)及其功能（一）病毒結(jié)構(gòu)蛋白（二）病毒非結(jié)構(gòu)蛋白四、呼腸孤病毒的復(fù)制（一）病毒的侵入（二）病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制（三）病毒粒子的組裝與釋放第四節(jié)動物-ssRNA病毒一、正粘病毒科（一）流感病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）流感病毒的基因組及其編碼蛋白1.P基因與P蛋白2.NP基因與NP蛋白3.HA基因和HA蛋白4.NA基因與NA蛋白5.RNA7基因及其編碼產(chǎn)物6.RNA8基因與NS1、NS2蛋白（三）流感病毒復(fù)制與基因表達的調(diào)控1.流感病毒粒子的侵入與脫殼2.流感病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄3.流感病毒基因組的復(fù)制4.流感病毒基因表達的調(diào)控（四）流感病毒粒子的組裝與釋放二、副粘病毒科（一）副粘病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）副粘病毒基因組及其編碼產(chǎn)物1.NP蛋白2.P蛋白3.C蛋白4.V蛋白5.L蛋白6.M蛋白7.病毒包膜糖蛋白8.肺病毒的NS1和NS2蛋白（三）副粘病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制三、彈狀病毒科（一）彈狀病毒粒子的結(jié)構(gòu)1.病毒包膜2.核衣殼（二）彈狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)（三）彈狀病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制1.病毒吸附、侵入和脫殼2.病毒基因組轉(zhuǎn)錄3.病毒基因組復(fù)制4.病毒粒子的組裝與出芽四、布尼亞病毒科（一）布尼亞病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）布尼亞病毒的基因組及其編碼蛋白1.SRNA節(jié)段的編碼產(chǎn)物2.MRNA節(jié)段的編碼產(chǎn)物3.LRNA節(jié)段的編碼產(chǎn)物（三）布尼亞病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制1.布尼亞病毒的轉(zhuǎn)錄2.布尼亞病毒的基因組復(fù)制五、沙粒病毒科（一）沙粒病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）沙粒病毒的基因組及其編碼蛋白（三）沙粒病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制（四）沙粒病毒的DI顆粒和DIRNA第五節(jié)動物+ssRNA病毒一、小RNA病毒科（一）小RNA病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）小RNA病毒的基因組（三）小RNA病毒的復(fù)制機制1.小RNA病毒的基本復(fù)制周期2.小RNA病毒的吸附、侵入和脫殼的機制3.多蛋白的合成與切割4.小RNA病毒基因組復(fù)制（四）小RNA病毒粒子的形態(tài)發(fā)生二、冠狀病毒科（一）冠狀病毒粒子的結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)蛋白圖1-1冠狀病毒粒子的結(jié)構(gòu)模式圖（動物病毒學(xué)殷震）Fig.1-1.ModelofCoronavirusParticle（二）冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)圖1-2.冠狀病毒基因組示意圖（分子病毒學(xué)徐耀先）Fig.1-2.ModelofCoronavirusGenome（三）冠狀病毒的復(fù)制機制1.冠狀病毒的感染2.冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制3.冠狀病毒mRNA的表達4.冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯后加工（四）冠狀病毒粒子的出芽與翻譯三、披膜病毒科（一）披膜病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）披膜病毒基因組的結(jié)構(gòu)圖1-4.冠狀病毒的復(fù)制模式（分子病毒學(xué)徐耀先）Fig.1-4ModelofCoronavirusReplication圖1-3亞基因mRNA的轉(zhuǎn)錄模式（分子病毒學(xué)徐耀先）Fig.1-3ModelofsubgenomicmRNATranscriptionORF1SORF3sMMNORF7UTRLeadersequcencePoly(A)CUAAACEncodedfragmentt+mRNA5’—mRNA3’12S34sM5M6N7圖.1-7冠狀基因組結(jié)構(gòu)及表達模式圖Fig.1-7Outlineofstructureandexpressionof（三）披膜病毒的復(fù)制與基因表達1.甲病毒的復(fù)制和基因表達2.風(fēng)疹病毒的復(fù)制（四）披膜病毒的DI顆粒四、黃病毒科（一）病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）病毒基因組的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白（三）病毒基因組的復(fù)制第十三章腫瘤病毒分子生物學(xué)與癌基因第一節(jié)DNA腫瘤病毒一、腺病毒（一）腺病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）腺病毒的復(fù)制循環(huán)（三）腺病毒引起細胞轉(zhuǎn)化的分子機制1.腺病毒轉(zhuǎn)化作用的基因片段2.腺病毒的轉(zhuǎn)化基因E1A和E1B及其編碼產(chǎn)物3.E1A和EIB蛋白的調(diào)節(jié)功能及其轉(zhuǎn)化活性二、多瘤病毒（一）病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）病毒基因組（三）病毒增殖性感染1.病毒的侵入2.早期基因表達3.晚期基因表達4.病毒粒子組裝和宿主細胞裂解（四）病毒基因表達的調(diào)控1.早期基因表達調(diào)控區(qū)2.晚期基因表達調(diào)控區(qū)3.增強子4.復(fù)制原點（五）SV40與小鼠多瘤病毒的轉(zhuǎn)化作用1.病毒轉(zhuǎn)化基因的發(fā)現(xiàn)2.病毒轉(zhuǎn)化蛋白的致癌機理三、乳頭瘤病毒（一）HPV型別與不同類型腫瘤1.皮膚疣與皮膚癌2.生殖道疣和生殖道癌3.口腔與呼吸道腫瘤（二）乳頭瘤病毒粒子結(jié)構(gòu)（三）乳頭瘤病毒基因組結(jié)構(gòu)（四）乳頭瘤病毒的基因表達1.早期基因表達2.晚期基因表達（五）乳頭瘤病毒的癌基因及其轉(zhuǎn)化作用機制四、皰疹病毒（一）皰疹病毒粒子的結(jié)構(gòu)（二）皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)及其功能1.病毒基因組的異構(gòu)體2.皰疹病毒的基因組3.病毒基因及其編碼產(chǎn)物（1）立即早期基因及其蛋白產(chǎn)物（2）早期基因及其蛋白產(chǎn)物（3）晚期基因及其編碼產(chǎn)物（4）病毒潛伏感染期表達的基因和蛋白產(chǎn)物1）EBNA基因家族2）LMP基因3）EBERs基因4.病毒基因組的調(diào)空區(qū)（三）皰疹病毒的基因表達與基因組復(fù)制1.病毒的基因表達2.病毒的基因組復(fù)制（四）皰疹病毒的細胞轉(zhuǎn)化及其致癌作用1.EBV的癌基因2.EBV癌基因的轉(zhuǎn)化作用3.ESV與腫瘤（1）EBV與鼻煙癌（2）EBV與BL（3）EBV與其他腫瘤第二節(jié)RNA腫瘤病毒——逆轉(zhuǎn)錄病毒一、RNA腫瘤病毒的分類地位（一）α逆轉(zhuǎn)錄病毒（二）β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬（三）γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬（四）δ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬（五）ε逆轉(zhuǎn)錄病毒屬二、病毒粒子的結(jié)構(gòu)三、病毒的基因組A型顆粒B型顆粒C型顆粒（一）基因組編碼區(qū)1.Gag基因⒉.pol基因3.pol基因4.env基因（二）基因組的末端結(jié)構(gòu)1.R序列2.U5序列3.PB位點4.先導(dǎo)序列5.PP序列6.U3序列四、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白1.包膜蛋白2.核心蛋白3.酶五、病毒的基因組復(fù)制與基因表達（一）基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄和原病毒DNA合成（二）原病毒DNA的整合（三）病毒基因的表達1.病毒基因的轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄后加工3.病毒mRNA的翻譯六、逆轉(zhuǎn)錄病毒的致癌作用與癌基因（一）病毒癌基因及其致癌機制1.Src與abl癌基因2.Sis癌基因3.erbB和fims癌基因4.Ras癌基因家族5.Myc癌基因及其核癌基因6.Mos與raf癌基因（二）原病毒DNA插入和整合對細胞癌基因的順式激活（三）HTLV-1調(diào)節(jié)蛋白P40tax的反式激活作用第三節(jié)人類免疫缺陷病毒的分子生物學(xué)一、HIV基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)制性（一）結(jié)構(gòu)基因1.Gag基因2.pol基因3.env基因（二）附加基因與調(diào)節(jié)基因1.Vif基因2.vpr基因3.tat基因4.rev基因5.Nef基因6.vpu基因7.vpx基因二、HIV基因表達的調(diào)控（一）LTR中的轉(zhuǎn)錄啟動子（二）增強子（三）Tat和Rev蛋白及其效應(yīng)元件對HIV基因表達的影響三、HIV感染的分子基礎(chǔ)（一）CD4與HIV的嗜親性（二）gp120與CD4分子在HIV吸附過程中的相互作用（三）gp120的V3環(huán)對HIV感染的影響四、HIV潛伏感染與激活五、AIDS的發(fā)生機理（一）細胞素與AIDS（二）T4細胞耗竭（三）自身免疫與B細胞激活六、抗HIV治療及其疫苗的展望（一）阻斷病毒吸附和建立感染（二）病毒逆轉(zhuǎn)錄和蛋白酶活性的抑制（三）HIV疫苗的研制第十四章亞病毒分子生物學(xué)第一節(jié)類病毒1.馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科2.鱷梨白斑類病毒科一、類病毒的分子結(jié)構(gòu)（一）T結(jié)構(gòu)區(qū)（二）P結(jié)構(gòu)區(qū)（三）C結(jié)構(gòu)區(qū)（四）結(jié)構(gòu)區(qū)二、類病毒的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換三、類病毒的復(fù)制和剪接第二節(jié)衛(wèi)星RNA和衛(wèi)星病毒一、衛(wèi)星RNA和衛(wèi)星病毒的分類1.A型衛(wèi)星2.B型衛(wèi)星3.C型衛(wèi)星4.D型衛(wèi)星二、衛(wèi)星RNA和擬病毒三、衛(wèi)星病毒第三節(jié)朊病毒一、朊病毒病二、朊病毒蛋白及其結(jié)構(gòu)型轉(zhuǎn)變?nèi)?、PrP基因與朊病毒蛋白的合成四、朊病毒的復(fù)制第四節(jié)丁型肝炎病毒一、HDV病毒粒子的結(jié)構(gòu)二、HDV的基因組三、HDV的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與翻譯四、HDV病毒粒子的組裝和釋放基因的克隆與表達

基因克隆(genecloning)基因表達(geneexpression)-原核基因表達

-真核基因表達基因克隆

GeneCloning概述克隆載體受體細胞體外重組的策略基因克隆工作流程一、概述確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的盆子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機理提出了中心法則和操縱子學(xué)說，破譯了遺傳密碼1973年Cohen完成第一個基因工程實驗經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：

限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細胞基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導(dǎo)入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。

基因克隆的核心-----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。

基因克隆的技術(shù)路線

目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA二、克隆載體復(fù)制基因(replicator)選擇性記號克隆位點三、受體細胞1、定義：外源DNA導(dǎo)入的細胞，是重組體擴增的場所。2、要求：易于接納外源DNA

無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶載體復(fù)制、擴增不受阻與載體有互補性四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡單高背景-載體自身環(huán)化雙向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到載體中的克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個相同酶切位點，可將另一末端補平2、平末端連接：酶切點為平末端或任何兩個末端補平的DNA效率低，酶用量大3、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、直接分離3、構(gòu)建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用于克隆原核生物的基因組文庫2、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）特點及應(yīng)用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況3、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選4、PCR擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進行PCR擴增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表達的基因（二）體外重組連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃

平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：1-3酶量：平端連接時需加大酶量（三）轉(zhuǎn)化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍白斑）原位雜交2、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR方向鑒定：聯(lián)合酶切測序基因的表達

GeneExpression一．表達系統(tǒng)：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載體及受體細胞。

據(jù)受體細胞的不同可分為：1．原核表達系統(tǒng)：將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達系統(tǒng)：使外源基因在真核細胞中表達的體系。二．原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。

3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)

4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位

原核生物基因表達的基本單位（即一個轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達調(diào)控。包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動基因，操作基因)、結(jié)構(gòu)基因5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：啟動子終止子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：

-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT-35區(qū)：

RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子，但并不開始轉(zhuǎn)錄各種啟動子啟動轉(zhuǎn)錄能力不同。啟動子強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG

或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列

三．外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解

四．影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。

常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。2、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度。AUG—SD間距離。AUG后的核苷酸

五．原核表達載體：

適用于在原核細胞中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子

SD順序篩選標志其它調(diào)控基因

類型：融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙

（一）融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA載體部分序列DNA序列位相載體----含有3種讀碼框的系列載體優(yōu)點：表達效率高產(chǎn)物穩(wěn)定

易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體融合型載體----pGEX系列（二）非融合型表達載體

PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因主要元件：強啟動子

SD：

ATG：第一個密碼子非融合型表達載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導(dǎo)插入位點--HpaI（三）分泌型表達載體：1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達，避免降解。

分泌型表達載體----pINIII-ompA1分泌型融合表達載體----pEZZ18六．提高表達水平的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水平強啟動子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達細菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主

Lac啟動子----LacI菌PL/PR--------CI857

溶源菌

3、誘導(dǎo)表達溫度誘導(dǎo)------PLPR/IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac

4、提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解七．表達產(chǎn)物的檢測：

1、特異性鑒定：熒光抗體法免疫沉淀法免疫印跡法ELISA2、生物學(xué)活性鑒定

八、原核表達系統(tǒng)的缺點1、沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進一步修飾加工真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢1.

具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2.

具翻譯后修飾系統(tǒng)3.

可實現(xiàn)真正的分泌表達4.基因治療真核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點（一）真核基因組的復(fù)雜性真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mRNA豐度不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體---表達調(diào)控多樣不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子沒有操縱子結(jié)構(gòu)(二）真核表達系統(tǒng)組成：真核表達載體受體細胞基因轉(zhuǎn)移方式據(jù)受體細胞及表達載體的不同分為3種：酵母表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)（三）轉(zhuǎn)化1、原生質(zhì)體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高（四）外源基因的表達1、胞內(nèi)表達2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列（五）缺點不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能

基因工程

所謂的遺傳工程就是在分子水平上，用人工方法提?。ɑ蚝铣桑┎煌锏倪z傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細胞，使外源ＤＮＡ在受體細胞中進行復(fù)制和表達。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。所以基因工程（geneengineering）也稱為遺傳工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重組技術(shù)（recombinationDNAtechniques）。有時人們還稱它為基因克隆（genecloning）或分子克?。╩olecularcloning）。

遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細胞，克隆轉(zhuǎn)化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。

第一節(jié)

基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)一、限制性核酸內(nèi)切酸（restrictionendonuclease）：這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶（

restrictionenzyme）。限制性內(nèi)切酶本來是微生物細胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶：分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，所以在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅱ型酶：分子量較?。?05Da），反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ型酶：這類酶可識別特定順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。

同裂酶（isoschizomers)：

指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：

指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoRI:來自于Escheriacoli

RY13的第一個限制酶。二、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應(yīng)與DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結(jié)構(gòu)。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A三、ＤＮＡ連接酶（DNAligase）

該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結(jié)合起來。

DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。

四、反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。五、DNApolI及Klenow片段

該酶常用于制備放射性比度比活體標記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（nicktranslation）法制備的。

該酶還用于裂口（gap）修補、反轉(zhuǎn)錄第二條鏈的合成（

Klenow）、隱蔽末端的填平反應(yīng)（

Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個片段，小片段（36KD）具有5’3’

核酸外切酶活性，大片段（76KD）稱為Klenow片段，具有DNA鏈聚合及3’5’核酸外切酶的活性。

六、S1核酸酶：

來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。七、堿性磷酸酶：

來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5’端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷反應(yīng)。

第二節(jié)

目的基因的制備一、化學(xué)合成法：

1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。

在體外，可以合成一系列長約幾百ｂｐ的寡聚核苷酸鏈，然后按照基因的順序?qū)⑦@些短的核苷酸鏈連接起來。

化學(xué)合成的不足之處在于：（１）要已知基因的核苷酸順序；（２）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（３）價格昂貴。

化學(xué)合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因。同時，所合成的基因不含內(nèi)含子。在原核生物中由于不能進行內(nèi)含子剪接，所以一旦將含有內(nèi)含子的基因引入原核生物中表達，其產(chǎn)物往往是沒有活性的。

由于化學(xué)合成法有上述一些優(yōu)缺點，所以這種方法較多地用于合成一些比較小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰島素基因，生長激素釋放抑制激素基因等。

由于技術(shù)的進步，目前已極少利用化學(xué)合成法制備目的基因，而是利用DNA的化學(xué)合成法合成一些短的DNA片段作為探針（probe）或PCR的引物。

二、從cDNA文庫或基因組文庫中分離

cDNA文庫及基因組文庫的構(gòu)造我們將在后面討論，如果制備好了cDNA文庫或基因組文庫，那么用原位雜交法來篩選（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。將這一克隆子大量繁殖，提?。模危粒憧色@得所需的目的基因。

必要的時候還可以建立差示文庫（differentiallibrary）。三、ＰＣＲ法：

PCR（polymerasechainreaction)技術(shù)是Mullis于1986年發(fā)明的一項體外快速大量擴增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎）。其基本原理就是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入欲被擴增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應(yīng)時，先加熱至約92℃，使模板變性。降溫至約50℃使引物與模板結(jié)合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重復(fù)92℃（變性）、50℃（復(fù)性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴增，可以重復(fù)幾十個周期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應(yīng)周期數(shù)）的倍數(shù)增加。四、mRNA差別顯示分離目的基因

根據(jù)表達特征，真核細胞的基因可以分為兩類：一是所謂的看家基因（house-keepinggene），另一類是發(fā)育調(diào)控基因（developmentalregulatedgene）。

在不同的生長時期、在個體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對外界環(huán)境的壓力的反應(yīng)、在個體的衰老與死亡等不同的環(huán)境下發(fā)育調(diào)控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differentialexpression）。mRNA的差別顯示技術(shù)就是用來分離這些差別表達的基因的一項有用的技術(shù)。

該技術(shù)是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全稱為mRNA差別顯示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)原理：該技術(shù)是利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴設(shè)計。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，polyA尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由11~12個T及兩個其它的堿基組成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。5’端引物：5’端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用一種3’錨定引物和一種5’隨機引物進行擴增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5’隨機引物。第三節(jié)

基因工程載體

載體（ｖｅｃｔｏｒ）是由在細胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：

分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。能獨立于染色體而進行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。有適合的標記，易于選擇。有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。

一、質(zhì)粒（plasmid）載體

質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀ＤＮＡ，一般大小約106~108D，可自身復(fù)制和表達，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當改選后便可成為良好的載體。

作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選擇性標記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）pUC系列：

是目前最常用的E.coli質(zhì)粒載體。包括pUC7、

pUC8、

pUC9、

pUC12、

pUC13、

pUC18、

pUC19、pUC118、pUC119等。優(yōu)點：分子量更小，拷貝數(shù)更高：分子量在3KB左右，拷貝數(shù)可達每細胞500~700個，因此不需要氯酶素擴增。引入多克隆位點（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便篩選。篩選原理——α互補——蘭白篩選：

LacZ’是lacZ基因的突變型，編碼半乳糖苷酶N端的146個氨基酸（全長1201氨基酸）。MCS也在這個區(qū)域內(nèi)。這類載體的適合宿主細胞必須是Z基因突變型，只具有Z基因C端的序列。當兩個Z基因的突變產(chǎn)物在一起時可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補，稱α互補。

具有α互補的細菌培養(yǎng)在含IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上會形成的蘭色菌落。相反，不互補則產(chǎn)生白色的菌落。X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此菌落為蘭色。如果在MCS位點上插入DNA片段導(dǎo)致插入突變，則不能產(chǎn)生α互補，因此菌落是白色的。

IPTG起誘導(dǎo)表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠高于乳糖。原核表達載體：pGEM系列包括pGEM-3、

pGEM-3Z、

pGEM-3Zf（-）、

pGEM-4、

pGEM-4Z等。帶有噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動子SP6及T7啟動子，可用于外源基因的表達。pGEX系列：

包括pGEX-1、

pGEX-1λT、

pGEX-2T、

pGEX-3X等。該系列是一類融合表達載體，在克隆位點上游有一個谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一個片段。融合位點上有特異蛋白酶水解位點，方便GST的去除。在GST上游有一個啟動子Ptac（trp操縱子啟動子與lac操縱子啟動子的融合啟動子），在IPTG誘導(dǎo)下表達。二、噬菌體（bacteriumphage,phage）載體：1、λ噬菌體載體：λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)：AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

頭部基因

尾部基因

功能不明區(qū)

溶原化

重組

早期控制

阻遏

DNA合成

溶菌生長非必須區(qū)段cI基因：溶原過程控制基因，插入式載體：λ噬菌體載體相對于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

由于λ噬菌體包裝時，只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較取代式為小。

cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A取代式載體：野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、

λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將Lac5作為選擇標記，使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。

Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40（左右臂連接）

（三段自身連接）

（插入片段）

為避免載體自身連接產(chǎn)生的假陽性，可采用雙酶解的方法。例如：