川丁特羅體外轉運和人體藥代動力學研究

川丁特羅體外轉運和人體藥代動力學研究川丁特羅(2-(4-氨基-3-氯-5-三氟甲基苯基)-2-叔丁氨基乙醇,trantinterol),是沈陽藥科大學程卯生教授采用Me-too策略,獨立研發(fā)具有自主自主知識產權的一種新型β2受體激動劑。藥理實驗表明,川丁特羅通過選擇性激動氣道平滑肌上的β2受體,使平滑肌松弛而發(fā)揮其抗哮喘的作用,有效性和安全性良好。本試驗首次建立了LC/MS/MS法用于測定生物樣品中川丁特羅的濃度,對川丁特羅進行臨床藥代動力學研究,這為本品臨床的安全、合理用藥奠定了基礎。同時,本試驗建立了體外MDCK-MDR1和Caco-2細胞模型,并探索了川丁特羅在人體內的轉運和吸收機制。一、川丁特羅人體藥代動力學的研究首次建立了一種LC/MS/MS分析方法,用于測定人血漿中川丁特羅的濃度。采用VenusilMPC18色譜柱(50×4.6mm,I.D.,5μm),以甲醇:水(含1%甲酸)(50:50,v/v)為流動相,流速為0.8mL/min,LC/MS/MS配有電噴霧離子化源,采用正離子化方式,在選擇反應監(jiān)測(MRM)模式下,選擇m/z311.2→m/z238.1和m/z277.2→m/z203.1為待測物川丁特羅和內標克倫特羅的定量離子對。方法確證表明,該方法的精密度和準確度、穩(wěn)定性、提取回收率和基質效應等均符合SFDA規(guī)定和要求。應用該方法對人口服給予川丁特羅25μg、50μg和100μg后的吸收情況進行系統(tǒng)研究。結果表明:3個劑量組的血漿中Cmax分別為12.2±4.2pg/mL,20.0±4.3pg/mL和48.6±14.3pg/mL;AUC0-t分別為87.0±40.7pg?h/mL、125.1±48.3pg?h/mL和222.9±64.8pg?h/mL。采用SPSS14.0軟件,對參數進行相關性分析,人體內的低、中、高三個劑量下的主要藥動學參數AUC0-t及Cmax均與給藥劑量呈線性相關。表明在25～100μg內,川丁特羅的體內過程呈線性藥代動力學特征,而其他參數如t1/2則不隨劑量變化而變化。考察進食對藥物吸收的影響結果表明,進食與空腹給藥后,藥物的Cmax無顯著性差異,AUC0-t有差異,進食對藥物的吸收有輕度影響。二、川丁特羅對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶的影響為了研究川丁特羅對主要代謝酶的影響,本文考察了健康Wistar大鼠連續(xù)7天灌胃給予川丁特羅(9.0μg/kg)后,大鼠肝微粒體的蛋白含量和CYP450酶總含量的變化以及主要亞型(CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19)的活性變化。結果表明:Wistar大鼠給藥后,肝微粒體中蛋白含量和CYP450總含量與空白對照組相比沒有顯著性差異,含量未見變化。幾種主要的亞型的活性也未受影響。由于CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19這5種酶的含量約占肝微粒體CYP450酶的90%,本試驗結果可初步推斷,川丁特羅不會抑制或誘導CYP450酶的產生和活力,即不會改變合并給藥時其他藥物的代謝速率,進而影響其藥效的發(fā)揮。三、川丁特羅HepG2細胞細胞色素P450mRNA表達的影響建立人肝癌(HepG2)細胞體外模型,首次考察了川丁特羅對人CYP450酶mRNA表達的影響,為臨床合聯合用藥提供理論依據。人肝癌細胞(HepG2)中分別加入濃度為2.4、12、60、300、1200和4800pg/mL的川丁特羅溶液,MTT法檢測藥物作用下的細胞增殖。采用RT-PCR法檢測HepG2細胞中CYP1A1,CYP2E1和CYP3A5亞型的mRNA表達量。結果顯示:在2.4~4800pg/mL的范圍內,川丁特羅未抑制HepG2細胞的增殖。與對照組相比,川丁特羅給藥組CYP3A5和CYP2E1mRNA表達無明顯變化,而CYP1A1mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。表明川丁特羅能明顯抑制HepG2細胞中CYP1A1mRNA表達,而對CYP3A5和CYP2E1表達則無抑制和誘導作用。四、川丁特羅在MDCK-MDR1細胞模型中的轉運研究建立MDCK-MDR1單層細胞體外藥物轉運模型,對模型進行評價。將MDCK和MDCK-MDR1細胞在Transwell多聚碳酸酯膜上培養(yǎng)5天后,考察了跨膜電阻、熒光黃的表觀滲透率和Rho123在細胞上的轉運。MDCK和MDCK-MDR1細胞的跨膜電阻分別為591.6±7.4?·cm2和140.4±6.6?·cm2,熒光黃的表觀滲透率為(Papp)分別為(2.35±0.23)×10-6和(4.51±0.28)×10-6cm/s。在Rho123的轉運試驗中,MDCK-MDR1的外排比率為5.16,明顯高于MDCK細胞,表明MDCK細胞在穩(wěn)定轉染人mdr1基因后,人源性P-gp產生高表達,外排功能增加。研究表明,成功建立MDCK-MDR1細胞模型,各項考察指標符合規(guī)定。川丁特羅對P-gp介導的Rho123在模型中外排的影響,結果顯示:10μmol/L和100μmol/L川丁特羅不同程度上均降低了Rho123的外排比率。Rho123的外排率從3.11降到了2.27和1.82。統(tǒng)計分析發(fā)現,加入川丁特羅后,Rho123在MDCK-MDR1細胞的Papp值與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。這表明川丁特羅抑制了P-gp介導的Rho123外排,可能為P-gp的抑制劑。在川丁特羅MDCK-MDR1細胞雙向轉運試驗中,采用LC/MS/MS法測定川丁特羅的含量。結果顯示:川丁特羅在MDCK-MDR1和MDCK細胞上外排率分別為1.2和1.05,凈外排率為1.14,表明川丁特羅不是P-gp的底物。在川丁特羅對P-gpATP酶的影響實驗研究中發(fā)現,川丁特羅能夠抑制ATP酶的活性,從而抑制P-gp的外排。五、川丁特羅在Caco-2細胞模型中的轉運研究建立Caco-2單層細胞模型,觀察Caco-2細胞間連接緊密,TEER>250?·cm2,熒光黃的Papp<0.5×10-6cm/s。結果表明,本實驗室所建立的Caco-2細胞模型指標符合要求。采用建立的Caco-2細胞模型考察