質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（CyTOF）常見FAQ

質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（CyTOF）常見FAQ問：CyTOF的檢測速度是多少？一管細胞需要檢測多久？答：CyTOF的檢測速度一般為500細胞/秒，如果檢測量為30萬個細胞的話，時間大約在10分鐘左右，每個樣本檢測量不同，根據(jù)檢測量檢測的時間會有上下浮動。問：CyTOF的樣本要求？我的樣本能做CyTOF嗎答：目前CyTOF檢測的樣本主要為人源樣本和小鼠源樣本，檢測類型包含外周血、骨髓、組織、細胞系、干細胞等多種樣本，CyTOF樣本的細胞量最好在4×106左右，且細胞活率應(yīng)大于70%。問：CyTOF這項技術(shù)成熟嗎？和單細胞測序比怎么樣？答：CyTOF這項技術(shù)的相關(guān)文獻已發(fā)表2100多篇，其中30%發(fā)表在《nature》、《Science》、《Cell》及其子刊上，是在蛋白質(zhì)層面研究單細胞的首選。單細胞測序作為一項同樣應(yīng)用廣泛的單細胞研究技術(shù)，其檢測通量（1萬細胞）低于CyTOF（100萬細胞），同時單細胞測序檢測的是RNA層面，而CyTOF檢測的是蛋白層面。問：CyTOF在送樣時有什么要求嗎？答：除了要滿足細胞數(shù)量（4×106）和活率（70%）的要求外，寄送的樣本類型也有一定要求。即便是使用低溫和保存液保存，長時間的寄送也會導(dǎo)致組織和外周樣本有一定的損傷，因此為了樣本的最佳狀態(tài)，推薦遠距離寄送前自主制備成單細胞懸液，然后梯度凍存后再干冰寄送。問：CyTOF每個組做幾例比較合適？答：目前在文獻中報道的小鼠源樣本，一般每組至少5例以上才能保證具有統(tǒng)計意義。人源樣本的個體差異較大，需要根據(jù)實驗方案再設(shè)計，在疾病特征研究或者預(yù)后標志物的發(fā)現(xiàn)中，樣本量是在能力范圍內(nèi)越多越好。問：CyTOF的抗體如何選擇？答：華盈生物目前設(shè)計了兩款CyTOF的抗體Panel，分別是針對人樣本的30markerPanel和小鼠樣本的33markerPanel，這兩個抗體組合可以覆蓋研究中常見的免疫細胞。同時也提供了10個左右的定制通道，可以根據(jù)研究目的進行選擇。同時可以進行抗體定制，在Panel中加入個性化的抗體。問：CyTOF的項目周期一般為多久？答：CyTOF項目周期主要根據(jù)樣本數(shù)量、抗體貨期、抗體是否需要定制來決定，如果僅使用固定Panel對20例以內(nèi)的樣本進行分析，周期一般在6-8周左右。問：CyTOF定制的抗體有什么要求嗎？如何選擇合適的抗體？答：CyTOF抗體定制即在一抗末端偶聯(lián)金屬標簽，一抗在知名抗體廠商如：Abcam、CST、ThermoFisher、Biolegend等多個品牌中均有售賣。最適選擇是抗體的應(yīng)用中包含：CyTOF，如果應(yīng)用中沒有CyTOF可以選擇含有FlowCytometry的抗體?？贵w偶聯(lián)的周期較長，實驗風險也相對較大。問：CyTOF的數(shù)據(jù)結(jié)果是什么樣的？如何對這些數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析呢？答：CyTOF數(shù)據(jù)結(jié)果為FCS格式文件，其中包含每一個細胞的所有marker的表達量，目前主流的平臺Cytobank和Flowjo均可以對CyTOF的結(jié)果進行處理和分析，同時一些高級分析在R上也可以實現(xiàn)，目前已有大量的CyTOF包在R上得到了廣泛的應(yīng)用。華盈生物在項目中會提供CyTOF基礎(chǔ)分析，幫助您發(fā)現(xiàn)更多細胞中的差異。問：CyTOF實驗的單細胞懸液如何制備？有什么要求嗎？答：CyTOF檢測的樣本最終狀態(tài)為單細胞懸液，制備的方法與流式細胞術(shù)單細胞懸液制備方法基本一致，但是因為CyTOF最終檢測的是金屬離子，因此在制備過程中需要避免使用含有金屬離子的試劑和儀器，例如含有Ca2+、Mg2+的PBS溶液。問：CyTOF的預(yù)實驗需要做什么準備嗎？答：如果實驗涉及的抗體僅包含膜蛋白，在預(yù)實驗過程中僅需要測試一下抗體的最佳濃度，如果包含胞內(nèi)蛋白則需要測試一下膜蛋白和胞內(nèi)蛋白的染色順序。因此客戶在提供樣本時需要額外提供預(yù)實驗的樣本。問：CyTOF可以對胞內(nèi)蛋白進行檢測嗎？答：CyTOF不僅可以對細胞的膜蛋白進行檢測還可以同步對胞內(nèi)蛋白和核蛋白進行檢測，同步實現(xiàn)對細胞、細胞因子和細胞功能狀態(tài)的研究。問：CyTOF如何實現(xiàn)超多抗體的同步檢測的？答：CyTOF的抗體尾部連接了金屬及其同位素的標簽，每一個原子量就是一個通道，這種標簽系統(tǒng)代替了傳統(tǒng)的熒光標簽系統(tǒng)，不會出現(xiàn)譜帶重疊，同時開發(fā)的通道也非常多，可以實現(xiàn)30-50種蛋白的同步檢測，同時最終檢測系統(tǒng)為ICP-MS系統(tǒng)，可以對金屬標簽進行高精度的檢測，最終兩個系統(tǒng)結(jié)合實現(xiàn)超多抗體的同步檢測。問：CyTOF檢測后能給我們提供什么結(jié)果？答：在我們的樣本中免疫細胞的數(shù)量和種類都十分龐大，CyTOF可以對樣本中的幾十種免疫細胞的含量進行檢測，從而發(fā)現(xiàn)在治療或者疾病發(fā)生過程中出現(xiàn)變化的免疫細胞，同時還可以針對這些免疫細胞的細胞因子進行分析。相關(guān)性分析還能幫助我們找到有關(guān)聯(lián)的細胞亞型，發(fā)現(xiàn)組織中的細胞關(guān)系。問：CyTOF只能用于腫瘤研究嗎？其他的領(lǐng)域可以做這項技術(shù)嗎？答：目前CyTOF的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，如血液、心血管、衰老、腫瘤、神經(jīng)、自身免疫等多個研究方向，因此這項技術(shù)不僅僅可以對腫瘤進行研究，還可以在其他的研究方向發(fā)光發(fā)熱。同時這項技術(shù)不僅可以在基礎(chǔ)研究中幫助我們發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵細胞機制，還可以結(jié)合臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)疾病預(yù)后標志細胞和疾病靶點。問：已經(jīng)進行過單細胞測序檢測了，還有必要做CyTOF嗎？答：目前已經(jīng)發(fā)表的文章中，有一部分研究人員會在單細胞測序后再使用CyTOF對之前的數(shù)據(jù)進行驗證，蛋白驗證核酸在我們的日常科研中也是很常見的。同時因為單細胞測序檢測細胞量較少，難免會遺漏一些含量少的細胞，而這些含量少的細胞可能恰恰是疾病中的關(guān)鍵細胞，因此質(zhì)譜流式可以幫助我們發(fā)現(xiàn)這樣稀少的細胞亞型。問：CyTOF發(fā)現(xiàn)差異細胞后如何進行下一步的研究呢？答：在我們使用CyTOF發(fā)現(xiàn)差異細胞之后我們可以針對這種細胞的功能進行研究，或者對細胞中的細胞因子進行研究；同時質(zhì)譜流式可以研究細胞的狀態(tài)，可以從狀態(tài)方面入手發(fā)現(xiàn)細