5-3血紅蛋白的提取和分離教學(xué)設(shè)計(jì)

§5.3 血紅蛋白的提取和分離教學(xué)目標(biāo)知識(shí)與技能1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理驟情感、態(tài)度與價(jià)值觀 初步形成科學(xué)的思維方式發(fā)展科學(xué)素養(yǎng)和人文精神教學(xué)難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填教學(xué)時(shí)數(shù)：2課時(shí)教學(xué)過(guò)程：教學(xué)內(nèi)容教師活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)教學(xué)意圖導(dǎo)入蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化和物。對(duì)蛋白質(zhì)的研究有助于人們對(duì)生命過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢傾聽(tīng)、回顧回顧舊知識(shí)凝膠色譜法（分酉己色譜法）蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、運(yùn)荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別、山此提取和分離各種蛋白質(zhì)口（）原理：分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。（）凝膠材料：多孔性，多糖類(lèi)化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。圣圣圣圣圣（）分離過(guò)程：混合物上柱一洗脫一大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢一收集大分子一收集小分子火洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。1緩沖溶液（）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如 一 ，等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制可同的緩沖液。（）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液的干擾而保持穩(wěn)定。i凝膠電泳法：（）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。（）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。（）分離過(guò)程：在一定下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的D形成“蛋白質(zhì)一 復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、純化、設(shè)計(jì)純度鑒定。思考：是否所有種類(lèi)的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。選擇實(shí)驗(yàn)材料（）你認(rèn)為鳥(niǎo)類(lèi)血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。（）請(qǐng)閱讀教材，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問(wèn)題:血液由和兩部分組成。血細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是。從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為：洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？ 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為血液+檸檬酸鈉f低速短時(shí)離心一吸出上層血漿f紅細(xì)胞十倍體積生理鹽水f緩慢攪拌 f低速短時(shí)離心一吸出上清液f反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色思考：加入檸檬酸鈉有何目的？ 為什么要低速、短時(shí)離心？ 為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀； 防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)？加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。補(bǔ)充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時(shí)，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法：紅細(xì)胞破碎混合液f中速長(zhǎng)時(shí)離心（ X ）f濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)f分液漏斗分離出血紅蛋白如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過(guò)性，大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜，離子和小分子能夠通過(guò)半透膜。在透析過(guò)程中，血紅蛋白溶液中離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到=的磷酸緩沖液中。思考：為何使用H的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。總結(jié)：通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其他種類(lèi)的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開(kāi)來(lái)呢？我們來(lái)研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟一一粗分離（凝膠色譜操作）。凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。根據(jù)教材圖一9說(shuō)出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。色譜柱的制作過(guò)程：準(zhǔn)備材料f加工橡皮塞f安裝色譜柱

下面進(jìn)行第二步一一凝膠色譜柱的裝填。請(qǐng)閱讀教材：色譜柱的裝填過(guò)程。步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱(chēng)量凝膠根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠照③配制懸浮液凝膠顆粒+蒸餾水f充分溶脹凝膠顆粒+洗脫液一沸水?、苎b填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡樣品加入和洗脫。其基本過(guò)程是：調(diào)節(jié)緩沖液面一加入蛋白財(cái)品f調(diào)節(jié)緩沖液面一洗脫一收集分裝蛋白質(zhì)至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng)：()紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。()凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡()色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。()色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。小結(jié)略作業(yè)：見(jiàn)優(yōu)化板書(shū)設(shè)計(jì)：課后反思:凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱(chēng)為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出