cdh1基因種系突變與家族性胃癌乳腺癌綜合征的關系

cdh1基因種系突變與家族性胃癌乳腺癌綜合征的關系

根據(jù)臨床研究，一些腫瘤有家族病史。換句話說，同一家腫瘤發(fā)病率很高，發(fā)病年齡很小。腫瘤的發(fā)生部位可以不局限于同一組織或器官。此種家族發(fā)病有呈常染色體顯性遺傳特點,以往稱之為“癌家族”,最近文獻將其稱為遺傳性癌癥綜合征。該家族中若包括先證者在內的一、二級親屬中有3人以上發(fā)生同一種癌腫,便可認為此癌腫極有可能與遺傳基因有關。迄今已經(jīng)確認的遺傳性癌癥綜合征超過20余種,外科領域中多見的有遺傳性非息肉病性大腸癌,遺傳性甲狀腺髓樣癌,遺傳性乳腺癌/卵巢癌綜合征和遺傳性胃癌/乳腺癌綜合征。最近,國際胃癌合作組織的報道顯示,遺傳性彌漫型胃癌家系成員CDH1突變基因攜帶者不但胃癌發(fā)病危險性增加,乳腺癌、結直腸癌發(fā)病危險性也增加。本實驗室2年來收集到1個獨特的中國人家族性癌癥綜合征家系,先證者2年內先后發(fā)生彌漫型胃癌及乳腺癌,其一、二級親屬中有5人患乳腺及結直腸癌等腫瘤,包括先證者在內的3人為乳腺癌。遂對該家系成員進行了CDH1基因種系突變分析及先證者胃癌/乳腺癌組織的病理學及CDH1基因編碼蛋白E-cadherin表達研究。材料和方法1.左乳腺癌保乳手術先證者,女,首發(fā)胃癌時41歲,父母為近親結婚。先證者于2001年11月在本科接受胃癌根治術,病理學檢查證實為彌漫型印戒細胞癌。2003年6月因左乳外上象限腫瘤在本科接受左乳腺癌改良根治術,病理檢查證實為乳腺浸潤性導管癌。先證者的一級、二級親屬中先后5人有乳腺癌、結直腸癌或兩肺轉移性癌家族史,另外1名姐妹因乳腺增生癥而定期隨訪觀察。收集該家系成員11人外周血備CDH1基因突變分析。2.cdh1基因多態(tài)性檢測收集目前可獲得的家系成員外周血各5ml,枸櫞酸鈉抗凝、混勻。淋巴細胞分離液分離白細胞,標準酚氯仿法抽提DNA。以樣本DNA為模板,分別加入CDH1基因第1~16外顯子引物進行PCR擴增(各外顯子引物序列及反應條件見表1)。對擴增產物行單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析。篩選出有電泳條帶異常的外顯子,對其PCR擴增產物純化后進行基因序列測定。3.免疫組化染色手術切除的胃癌/乳腺癌標本用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片3μm。其中1張行H-E染色,觀察組織病理形態(tài),另2張進行E-cadherin和β-catenin單克隆抗體免疫組化染色。E-cadherin與β-catenin單克隆抗體以及EnVision兩步法免疫組化試劑購自Dako公司。CDH1基因1~16外顯子引物及反應條件見表1。4.pcr檢測方法先證者病理組織標本采用英國Shandon公司全自動組織脫水機、石蠟包埋機處理,石蠟切片機切片。日本OlympusBX51診斷顯微鏡觀察,攝像。PTC-200PCR擴增儀為美國MJResearch產品。電泳凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO-RAD產品。DNA測序儀為美國ABI產品。結果1.外顯子檢測異常圖1為該多發(fā)性癌癥綜合征家系圖譜。通過PCR-SSCP法篩選,除第13外顯子外,其余外顯子均未檢測到異常。外顯子13的電泳結果顯示,包括先證者在內,該家系中有3人電泳條帶異常,見圖2,其中1人為先證者兄長,40歲時已接受直腸癌切除術,另1人為先證者外甥女,29歲,未發(fā)病。2.pcr-sscp分析對家系所有成員的外周血DNA應用第13外顯子PCR擴增產物進行DNA序列測定。測序結果顯示,在PCR-SSCP分析中有電泳條帶異常者,其第13外顯子mRNA水平2200位點(序號:NM-004360)存在C→T單個核苷酸置換,使編碼序列由GCC→GCT,突變前后兩序列均編碼丙氨酸(Ala154Ala),見圖3。3.蛋白-catenin表達先證者胃癌為8cm×8cm,浸潤潰瘍型。顯微鏡下,瘤細胞散在排列,彌漫浸潤于胃壁內,不形成腺體,浸潤達深肌層;單個細胞內可見黏液潴留,呈典型的印戒細胞癌組織像,見圖4。CDH1編碼蛋白E-cadherin單克隆抗體免疫組化染色顯示,大部分瘤細胞尚保留E-cadherin表達,部分區(qū)域E-cadherin表達較周圍正常胃黏膜有所下降,見圖4。與E-cadherin共同發(fā)揮細胞粘附功能的蛋白β-catenin單克隆抗體免疫組化染色證實,大部分癌組織也保留β-catenin陽性染色。先證者左乳腺腫瘤為2cm×1cm。顯微鏡下見瘤細胞呈片狀、巢狀排列,部分癌巢中央可見壞死。癌巢與癌巢間為纖維組織間質,腫瘤細胞異形性明顯,核分裂像易見,呈典型的浸潤性導管癌組織像,見圖5。E-cadherin單克隆抗體免疫組化染色顯示,與周圍殘存的良性導管上皮相比,瘤細胞E-cadherin及β-catenin蛋白表達均有所下降,見圖5。cdh1基因家系分析及病理研究多年臨床實踐發(fā)現(xiàn),有些家族存在胃癌及乳腺癌聚集現(xiàn)象,先證者可同時或異時患胃癌及乳腺癌,且此種家族中患病者發(fā)病年齡均較輕,以40歲前后發(fā)病居多,一般首發(fā)年齡不超過50歲。隨著分子生物學技術向臨床研究的深入,對同一家族中兩代人內有3人以上發(fā)生同一癌腫家系的分析發(fā)現(xiàn),該種家系內往往存在某種基因的種系突變。如以彌漫型胃癌家系為例,自1998年Guilford等首次報道新西蘭毛利人胃癌家系中存在CDH1基因種系突變以來,CDH1基因的種系突變與年輕發(fā)病的彌漫型胃癌的關系已引起廣大腫瘤研究者的關注。此后又有研究顯示,CDH1基因種系突變攜帶者的彌漫型胃癌和乳腺小葉癌發(fā)病率均增加,認為CDH1基因是與彌漫型胃癌及乳腺小葉癌關系密切的基因。但晚近研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌高發(fā)家系中,乳腺癌的組織學類型與基因突變關系并不密切,無論是乳腺導管癌還是小葉癌均可發(fā)生CDH1基因突變。迄今尚未見有關中國人胃癌/乳腺癌先證者的家族性癌癥綜合征家系CDH1基因種系突變分析及臨床病理特征的報道。本實驗室收集的家系內先證者為異時性發(fā)生、年輕發(fā)病(首發(fā)胃癌時為41歲)的彌漫型胃癌/乳腺癌患者,因家系一級、二級親屬中5人有年輕發(fā)病的癌腫病史,其中結直腸癌1人,死于轉移性肺癌2人,乳腺癌3人,所有發(fā)病者發(fā)病時年齡均未超過50歲,遂將該家系納入基因突變分析研究。首先,我們選擇了在遺傳性彌漫型胃癌/遺傳性乳腺癌家系報道較多的CDH1基因進行外周血CDH1種系突變分析。已知CDH1基因位于第16號染色體長臂,是具有16個外顯子的抑癌基因,編碼120×103的E-cadherin糖蛋白,表達于上皮細胞膜。E-cadherin的主要功能是通過與胞質內β-catenin結合,介導同種上皮細胞之間的連接,維持上皮細胞極性。E-cadherin蛋白變異將導致上皮細胞間的連接喪失,使細胞遷移性增加。對該家系成員CDH1基因突變分析表明,盡管包括先證者在內3人存在CDH1第13外顯子mRNA水平2200位點C→T單個核苷酸置換,但未造成編碼氨基酸改變,在遺傳學上稱為同義突變(即沉默性突變)或屬于單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。對先證者胃癌及乳腺癌組織的CDH1編碼蛋白E-cadherin表達研究顯示,盡管部分腫瘤細胞E-cadherin蛋白表達減弱,但大部分瘤細胞尚可見E-cadherin蛋白表達,與CDH1基因分析結果吻合,可以認為該家系中檢測到的單個核苷酸置換未引起編碼蛋白變異。至于部分腫瘤細胞蛋白表達減弱可能與腫瘤細胞較正常上皮細胞分化程度偏低有關。對先證者胃癌以及乳腺癌標本的組織病理學研究顯示,異時性發(fā)病的胃癌為典型的印戒細胞型彌漫型胃癌,而左乳腺腫瘤為典型的浸潤性導管癌,兩種癌腫之間并無形態(tài)學