復(fù)元膠囊對實驗性大鼠晚期膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3及型膠原表達的影響

復(fù)元膠囊對實驗性大鼠晚期膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3及型膠原表達的影響

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)樘卣鞯募膊　Ｖ嗅t(yī)發(fā)病率高，損傷率高。其病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨的退行性變、軟骨下骨硬化、骨贅形成和軟骨下囊性變以及細胞外源性骨折。是骨關(guān)節(jié)炎疾病的重要環(huán)節(jié)之一。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一類廣泛存在于結(jié)締組織中的結(jié)構(gòu)相似、酶活性依賴于Zn2+的蛋白酶超家族,已發(fā)現(xiàn)有20種。MMPs是降解細胞外基質(zhì)的主要酶系,目前主要有5個亞型,能降解幾乎所有的軟骨細胞外基質(zhì),主要以降解Ⅱ型膠原和蛋白多糖為主,從而使關(guān)節(jié)軟骨腫脹,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變。復(fù)元膠囊是復(fù)元方的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑,可通過調(diào)節(jié)細胞因子和生長因子的表達,減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解,促進細胞增殖、減少細胞凋亡,從而發(fā)揮對骨關(guān)節(jié)炎的防治作用。復(fù)元膠囊對MMPs的影響,作者尚未見報道。本研究觀察復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-3和Ⅱ型膠原的影響,探討復(fù)元膠囊防治骨關(guān)節(jié)炎的機制。單次給藥對大鼠膝關(guān)節(jié)總評分的影響動物和藥品8周齡雄性SD大鼠60只,體重(200±10)g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝)2012-0001。復(fù)元膠囊:重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準文號:渝衛(wèi)2002[42-33],成分主要為鹿角膠、人參、骨碎補、川芎、枸杞子、丹參、黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉等,每粒0.41g,每克粉末含生藥3g?？构窃錾z囊:江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn),批號:110402。試劑和儀器MMP-1和MMP-3多克隆抗體,購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Ⅱ型膠原多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SABC試劑盒和二甲苯聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司;SDS-PAGE凝膠試劑盒和RIPA蛋白提取試劑盒購自碧云天公司。BX50型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司),BIO-RAD電泳儀(美國BIORAD公司),BIO-RAD凝膠成像儀(美國BIORAD公司)。分組和造模將大鼠隨機分為正常組、模型組、抗骨增生膠囊組、復(fù)元膠囊低劑量組、復(fù)元膠囊中劑量組、復(fù)元膠囊高劑量組,每組10只。除正常組外,其余五組采用Hulth法建立晚期骨關(guān)節(jié)炎模型。用10%水合氯醛按照0.3mL·100g-1腹腔注射麻醉大鼠,在無菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板并剪斷前后交叉韌帶,逐層縫合,無菌包扎。術(shù)后7d給予青霉素肌內(nèi)注射抗感染。青霉素給藥1周后,每日驅(qū)趕大鼠跑步30min,持續(xù)12周。正常組大鼠不給予任何處理。給藥方法依據(jù)Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量,用電子稱稱取所需量的復(fù)元膠囊和抗骨增生膠囊粉末,用生理鹽水配置成相應(yīng)濃度,置于酒精燈上加熱溶解后,冷卻備用?？构窃錾z囊組予抗骨增生膠囊557mg·kg-1·d-1,復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65、743.30、2229.90mg·kg-1·d-1,均以生理鹽水配置成3mL溶液,而正常組和模型組給予等體積生理鹽水,于術(shù)后第2周開始,每日灌胃1次,持續(xù)12周。觀察指標1一般情況觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度、患肢疼痛反應(yīng)等一般情況。根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹評分標準進行評價:0分,無腫脹;1分,輕度腫脹;2分,中度腫脹;3分,明顯腫脹。2關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)給藥12周末處死各組,大體觀察關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況,按Pelletier-JP標準評價關(guān)節(jié)軟骨大體情況:0分,關(guān)節(jié)面光整,色澤如常;1分,關(guān)節(jié)面粗糙,有小的裂隙且色澤灰暗;2分,關(guān)節(jié)面糜爛,軟骨缺損深達軟骨表中層;3分,關(guān)節(jié)面潰瘍形成,缺損深達軟骨深層;4分,軟骨剝脫,軟骨下骨質(zhì)暴露。取脛骨平臺全層軟骨連同軟骨下骨標本,一部分置于-80℃保存;一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定24h,10%EDTA脫鈣15d,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量和潮線的完整性。依據(jù)Mankin’s法評價關(guān)節(jié)軟骨:0級為正常,1級為表層破壞,2級為血管翳及表層破壞,3級為淺層裂隙形成,4級為局限性深達骨質(zhì)的裂隙,5級為大面積深達骨質(zhì)的軟骨缺如,6級為負重區(qū)軟骨全部丟失。3關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-3和Ⅱ型膠原的表達(1)采用免疫組化法檢測MMP-1、MMP-3的蛋白表達。切片脫蠟,用3%H2O2在室溫條件下滅活內(nèi)源性過氧化物酶,15min后,用PBS沖洗3次。胰蛋白酶消化液修復(fù)抗原活性20min,正常山羊血清封閉20min,分別滴加1∶50的兔抗大鼠MMP-1和MMP-3多克隆抗體,4℃孵育過夜,PBS沖洗3次。滴加二抗,37℃孵育30min,PBS沖洗3次。滴加SABC-HRP,37℃孵育30min,PBS沖洗3次。DAB室溫下顯色,封片。圖像分析:每個標本取5張切片,隨機取5個視野,采用Image-ProPlus圖像分析軟件測定陽性染色積分吸光度(D)。(2)采用Westernblot法檢測軟骨中MMP-1、MMP-3及Ⅱ型膠原的蛋白表達量。隨機從每組選3個標本,獨立標本重復(fù)3次實驗。于-80℃中取出軟骨組織,用RIPA試劑盒提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,按每孔50μg上樣,在10%的SDS-PAGE凝膠上電泳后,用濕法轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至0.45μm孔徑的PVDF膜上,用5%BSA在37℃條件下封閉2h后,分別敷上抗MMP-1、MMP-3和抗Ⅱ型膠原(1∶500稀釋)及抗β-actin的多克隆抗體(1∶1000稀釋),4℃過夜,用TBST洗3次。然后分別敷上羊抗兔及抗小鼠抗體,37℃條件下放置1h后,用TBST沖洗3次。在暗室中敷上BeyoECL發(fā)光液,采用ChemiDocXRS凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行顯影,并采用QuantitiyOne軟件計算條帶的灰度值,以目的條帶與β-actin比值為結(jié)果。統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。等級資料組間比較采用Ridit分析。P<0.05為差異有顯著意義。各組小鼠骨髓組織及免疫指標變化一般情況模型組大鼠膝關(guān)節(jié)局部刺激有疼痛反應(yīng),患肢收縮痙攣,后肢跛行明顯,蹬地力量明顯減弱,伴有關(guān)節(jié)不穩(wěn),12周時大鼠膝關(guān)節(jié)明顯畸形腫大,關(guān)節(jié)屈伸不利,活動度受限。各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)局部軟組織腫脹消失,傷口愈合,局部刺激無疼痛,后肢可見跛行,蹬地力量較模型組好轉(zhuǎn),12周后關(guān)節(jié)有畸形,關(guān)節(jié)可后伸。正常組關(guān)節(jié)外部結(jié)構(gòu)正常,無腫脹,活動自如。模型組關(guān)節(jié)腫脹評分高于正常組(P<0.05),而各給藥組評分均低于模型組(P<0.05),見表1。關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)大體形態(tài)觀察顯示,正常組關(guān)節(jié)面平滑光整,呈淡藍色,色澤明亮,沒有裂紋及軟化灶,滑膜無增生,關(guān)節(jié)液呈透明色。模型組軟骨面大量糜爛,呈灰暗色,無光澤,軟骨邊緣有明顯增生,多數(shù)標本可見大小不等、深淺不一的潰瘍,有的可深達骨質(zhì),軟骨下骨明顯暴露,滑膜有不同程度的增生黏連,關(guān)節(jié)液明顯增多,呈混濁狀。復(fù)元膠囊低、中劑量組及抗骨增生組軟骨面稍粗糙,呈淡黃色,軟骨邊緣可見增生,部分出現(xiàn)裂紋及小潰瘍面,滑膜可見少許增厚黏連,關(guān)節(jié)液略增多。復(fù)元膠囊高劑量組軟骨面較粗糙,可見少許裂紋。按Pelletier-JP標準比較各組關(guān)節(jié)大體情況,見表2。HE染色后觀察顯示,與正常組相比,模型組軟骨組織層明顯變薄,出現(xiàn)深達骨質(zhì)層的裂隙、軟骨缺如及軟骨丟失,潮線出現(xiàn)嚴重斷裂模糊。與模型組比較,復(fù)元膠囊高劑量僅可見少量細胞簇聚集,可見雙重潮線;復(fù)元膠囊中劑量組細胞染色較為均勻,而抗骨增生膠囊組和復(fù)元低劑量組軟骨組織細胞層增生比較明顯,細胞數(shù)量明顯增加,潮線紊亂,見圖1。模型組Mankin’s評分顯著高于正常組(P<0.01),各給藥組Mankin’s評分均低于模型組(P<0.05或P<0.01),復(fù)元膠囊中、高劑量組Mankin’s評分均低于抗骨增生膠囊組模型組(P<0.05或P<0.01),復(fù)元膠囊高劑量組Mankin’s評分低于復(fù)元膠囊低、中劑量組(P<0.05或P<0.01),見表3。軟骨組織中MMP-1、MMP-3的蛋白表達免疫組織化學(xué)檢測中,正常組軟骨組織中可見少許陽性顆粒表達;其余各組軟骨組織見不同程度著色,軟骨細胞的胞漿中可見黃色顆粒著色,軟骨全層均見陽性顆粒;與模型組相比,各給藥組陽性顆粒均減少,尤其以MMP-1最為顯著,見圖2和圖3。免疫組織化學(xué)和Westernblot法檢測結(jié)果均顯示,與正常組比較,模型組軟骨中MMP-1和MMP-3的蛋白表達量顯著增高,Ⅱ型膠原含量顯著降低,差異具有非常顯著意義(P<0.01)。各給藥組與模型組比較,MMP-1和MMP-3的蛋白表達量均降低,Ⅱ型膠原含量增高(P<0.05或P<0.01)。復(fù)元膠囊低、中劑量組與抗骨增生膠囊組比較,無顯著差異(P>0.05);復(fù)元膠囊高劑量組MMP-1及MMP-3表達低于抗骨增生膠囊組,Ⅱ型膠原含量高于抗骨增生膠囊組(P<0.01)。復(fù)元膠囊低、中劑量組MMP-1、MMP-3和Ⅱ型膠原組間比較無顯著差異(P>0.05),兩組MMP-1、MMP-3表達均高于復(fù)元膠囊高劑量組,而Ⅱ型膠原含量低于復(fù)元膠囊高劑量組(P<0.05或P<0.01)。見表3、4和圖4。復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎的影響骨關(guān)節(jié)炎是老年人致殘的首發(fā)疾病,主要累及膝和髖關(guān)節(jié),據(jù)世界衛(wèi)生組織估計骨關(guān)節(jié)炎至少使60歲以上人群中10%的人喪失勞動力。目前尚缺少疾病治療措施的情況下,加強對骨關(guān)節(jié)炎的防治至關(guān)重要。中醫(yī)認為骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇,病因病機為氣血不足,肝腎虧虛,風(fēng)寒濕侵入骨髓,痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng),證屬肝腎虧虛、氣滯血瘀,治法以補腎壯骨、益氣活血為主。復(fù)元膠囊中人參、黃芪益氣活血,川芎、丹參行氣活血,有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補腎壯陽、強筋健骨,有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用,且性激素有促進軟骨細胞增殖的作用?？构窃錾z囊已是臨床治療骨關(guān)節(jié)炎有效的中成藥,能夠抑制軟骨細胞凋亡及MMPs的產(chǎn)生,因此本研究選用抗骨增生膠囊作為陽性對照。本研究結(jié)果顯示,模型組關(guān)節(jié)腫脹評分、Pelletier-JP分級標準和Mankin’s評分均高于正常組,Ⅱ型膠原含量明顯低于正常組,表明本實驗造模成功。各給藥組關(guān)節(jié)腫脹評分、Pelletier-JP分級標準和Mankin’s評分均低于模型組,提示復(fù)元膠囊和抗骨增生膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎有效,與既往實驗結(jié)果一致。Ⅱ型膠原的表達量在復(fù)元膠囊各劑量組和抗骨增生膠囊組中有不同程度的增加,以復(fù)元膠囊高劑量組明顯,說明復(fù)元膠囊高劑量組療效優(yōu)于復(fù)元膠囊低、中劑量組。MMP-1是成纖維細胞型膠原酶,與膠原纖維結(jié)合后激活,可切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原,以Ⅱ型膠原為主。Ⅱ型膠原含有一個長的三螺旋區(qū)域,MMP-1在距離氨基末端約3/4的特異位點裂解Ⅱ型膠原,從而導(dǎo)致α-鏈解旋變性,變性后的α-鏈可被MMP-2(明膠酶)、MMP-3(基質(zhì)降解素1)和MMP-9等二次裂解。MEHRABAN等在兔骨關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn),軟骨中MMP-3在疾病較后期表達上調(diào),加重軟骨破壞。MMP-3除了自身可直接降解蛋白多糖和Χ型膠原、破壞關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)定性外,還可以通過激活MMP-1達到降解Ⅱ型膠原的作用。此外,黃勝等研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎早、晚期,MMP-3的變化和軟骨細胞的凋亡指數(shù)均存在相關(guān)性,MMP-3的升高可能是導(dǎo)致軟骨基質(zhì)破壞、軟骨細胞凋亡的重要因素。MMPs抑制劑可用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。本研究結(jié)果顯示,正常組軟骨中MMP-1和MMP3表達量少,而在模型組中大量表達,提示可能在骨關(guān)節(jié)炎病變過程中,由于細胞外基質(zhì)的降解和合成失衡,在多因素的作用下MMP-1和MMP-3表達增加,從而