hmlh1基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)azaddp細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的研究

hmlh1基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)azaddp細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的研究

近年來(lái)，癌癥的發(fā)病率和死亡率有快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，化療和抗化療已經(jīng)成為癌癥治療中必須解決的難題。隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入,研究認(rèn)為某些基因啟動(dòng)子甲基化和腫瘤耐藥關(guān)系密切,可用于預(yù)測(cè)腫瘤化療效果。DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(mismatchrepairsystem,MMR)是人體細(xì)胞中存在的一種能識(shí)別并修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的安全保障系統(tǒng)。hMLH1基因是一系列DNA錯(cuò)配修復(fù)基因中最重要的一種,也是MMR系統(tǒng)的重要成分,其甲基化可導(dǎo)致MMR缺陷。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)hMLH1的失活不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),還可能導(dǎo)致某些腫瘤對(duì)某些抗腫瘤藥物耐藥。由于hMLH1基因甲基化是肺癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一。因此本研究旨在探討hMLH1基因與肺癌細(xì)胞化療耐藥方面的作用機(jī)制,為肺癌治療提供新的靶點(diǎn)。1材料和方法1.1菌株和試劑人肺腺癌A549細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤中心保存。人肺腺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心,由北京大學(xué)腫瘤臨床學(xué)院建系,其親本細(xì)胞A549來(lái)源于ATCC。順鉑購(gòu)于山東齊魯制藥公司;5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’-eoxycytidine,5-Aza-CdR)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)A3656)。5-Aza-CdR是一種常用的去甲基化藥物,本研究根據(jù)文獻(xiàn)采用無(wú)毒低劑量(0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0μmol/L)5-Aza-CdR對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP產(chǎn)生干預(yù)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司;甲基化修飾試劑盒購(gòu)自美國(guó)ZYMO公司;CpG甲基化酶(SssImethylase)購(gòu)自美國(guó)NEB公司;Annexin-ⅤFITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物有限公司;Hoechst33258購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。1.2方法1.2.1rt-pcr檢測(cè)復(fù)蘇A549及A549/DDP細(xì)胞接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每1~2d換液或傳代,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。A549/DDP培養(yǎng)液中加入2.0μg/mL順鉑以維持其耐藥表型。RNA抽提:收集A549和A549/DDP細(xì)胞并加入適量TRIzol,每1mLTRIzol加0.2mL氯仿,室溫放置5min;12000×g離心15min;每1mLTRIzol加0.5mL異丙醇,12000×g離心15min;DEPC水配制的75%乙醇洗滌RNA沉淀1次;空氣干燥,DEPC水溶解。貯存于-70℃。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按RT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,PCR反應(yīng)條件:hMLH1:95℃5min,94℃30s、58℃30s、72℃1min共35個(gè)循環(huán)72℃延伸5min;β-actin:95℃1.5min,94℃30s、52℃30s、72℃30s共35個(gè)循環(huán),72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物在0.15%的瓊脂糖凝膠中電泳20min后,在凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影照相存檔。1.2.3msp檢測(cè)1.2.3.dna的提取細(xì)胞DNA提取采用胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,每106~107個(gè)細(xì)胞中加入500μL細(xì)胞裂解緩沖液,加入蛋白酶K消化,常規(guī)酚/氯仿抽提法抽提DNA。外周血DNA提取采用常規(guī)酚/氯仿抽提法抽提DNA。甲基化陽(yáng)性對(duì)照DNA的處理,取健康志愿者外周血DNA1μg,S-腺苷甲基硫氨酸0.2μL,緩沖液4μL,甲基化酶SssI0.25μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至40μL,于37℃循環(huán)反應(yīng)3h,所得DNA作為甲基化陽(yáng)性對(duì)照。1.2.3.2天竺葵裝飾每例取制備的DNA約1500ng。后按EZDNA甲基化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2.3.pcr擴(kuò)增條件MSP引物參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì),甲基化hMLH1:上游引物5’-ACG-TAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3’,下游引物5’-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3’,115bp,退火溫度63℃;非甲基化hMLH1:上游引物5’-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTT-GT-3’,下游引物5’-ACCACCTCATCATA-ACTACCCACA-3’,124bp,退火溫度為62℃。PCR擴(kuò)增條件95℃5min,94℃30s、63/62℃30s、72℃50s共40個(gè)循環(huán),72℃7min延伸,4℃保存。在2%瓊脂糖凝膠中電泳30min后,凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影照相存檔。1.2.4dmso-pcr反應(yīng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549、A549/DDP細(xì)胞,用10%滅活新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成的單細(xì)胞懸液1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板液中,每孔200μL,實(shí)驗(yàn)組分別加入0.2、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0μmol/L的順鉑,另設(shè)對(duì)照組(不加藥)和空白組(只有培養(yǎng)基),每組設(shè)3個(gè)平行孔。48h后,每孔加入5mg/mL的MTT20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h棄上清液,每孔加入150μLDMSO,避光振蕩10min,用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于492nm處測(cè)定吸光度A值。分別計(jì)算各組IC50值,耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50,逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)=單用順鉑時(shí)耐藥細(xì)胞IC50/5-Aza-CdR與順鉑合用后耐藥細(xì)胞IC50。1.2.5繼續(xù)溫育和溫育混養(yǎng)箱繼續(xù)溫育取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,3×105個(gè)/孔接種于放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔約2mL,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱繼續(xù)溫育48h。吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,加入0.5mL4%多聚甲醛固定10min,PBS沖洗,加入1mL的10μg/mLHoechst33258染色液,室溫放置3~5min,吸除Hoechst33258染色液,用PBS洗滌,取出蓋玻片,置于載玻片上,加入1滴抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的鑒定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱繼續(xù)溫育48h。收集細(xì)胞,把密度調(diào)至2.5×105~5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,分別取1mL加入5mL試管,500~1000×g離心5min,4℃冷PBS液洗滌2次,1mL冷PBS重懸細(xì)胞,500~1000×g離心5min,用200μL的BindingBuffer稀釋,加入FITC標(biāo)記的Annexin-V10μL和PI5μL,室溫避光15min,加入300μLBindingBuffer,立即用FCM進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料中正態(tài)分布數(shù)據(jù)用表示。根據(jù)直線回歸計(jì)算各藥物的IC50,正態(tài)分布的兩組以上的數(shù)據(jù)的比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的比較采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn),相關(guān)性分析用Pearson’s相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1-aza-cdr檢測(cè)hmlh1mrna表達(dá)從RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)(圖1),在分子量標(biāo)準(zhǔn)為215bp位置,A549及A549/DDP細(xì)胞均出現(xiàn)hMLH1擴(kuò)增條帶,A549細(xì)胞中hMLH1mRNA表達(dá)明顯高于A549/DDP細(xì)胞,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著5-Aza-CdR濃度為0、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L時(shí),hMLH1mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)隨著5-Aza-CdR濃度增加,hMLH1mRNA的相對(duì)表達(dá)量也增高,呈濃度依賴性(γ=0.865,P<0.05)。20.0與10.0μmol/L5-Aza-CdR作用A549/DDP細(xì)胞后,hMLH1mRNA的相對(duì)表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),可見(jiàn)濃度為10.0μmol/L時(shí),5-Aza-CdR可使A549/DDP細(xì)胞中hMLH1mRNA高表達(dá)。2.2甲基化細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞僅出現(xiàn)非甲基化條帶(U),為hMLH1非甲基化細(xì)胞株;耐藥細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)甲基化(M)和非甲基化(U)條帶,為hMLH1部分甲基化細(xì)胞株。通過(guò)對(duì)10.0μmol/L的5-Aza-CdR干預(yù)A549/DDP細(xì)胞后出現(xiàn)非甲基化條帶(U),用凝膠電泳分析軟件QuantityOne對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得出平均光密度值(OD),經(jīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。2.3-asa-cdr對(duì)a549/ddp細(xì)胞的抑制效果結(jié)果顯示順鉑干預(yù)48h后對(duì)A549細(xì)胞的IC50為(4.7±0.7)μmol/L,而對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50約為(30.1±1.8)μmol/L,后者的耐藥倍數(shù)為A549細(xì)胞的6.37倍,可見(jiàn)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖具有抑制作用,但與A549細(xì)胞相比A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑耐受明顯。所以A549/DDP細(xì)胞被確定為耐順鉑的肺癌細(xì)胞株。加入10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h后,順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50約為(6.9±0.6)μmol/L,逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥倍數(shù)約為4.33倍。結(jié)果明顯可見(jiàn)10.0μmol/L5-Aza-CdR可提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,但仍比親本細(xì)胞A549對(duì)順鉑的敏感性低。經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。2.4凋亡細(xì)胞的檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞與10.0μmol/L5-Aza-CdR干預(yù)48h后的A549/DDP細(xì)胞形態(tài)規(guī)則均呈圓形均勻的淡藍(lán)色,基本未見(jiàn)凋亡細(xì)胞,兩者無(wú)明顯差異,可見(jiàn)10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h對(duì)A549/DDP細(xì)胞的凋亡作用較小。經(jīng)20.0μmol/L順鉑干預(yù)后,A549/DDP細(xì)胞在倒置熒光鏡下可見(jiàn)部分凋亡細(xì)胞,即細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染顆粒塊狀熒光,不規(guī)則,大小不等,可見(jiàn)凋亡小體;而5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞在倒置熒光鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多(圖4)。2.5兩組患者預(yù)后的a549/ddp細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)比較A549/DDP細(xì)胞與10.0μmol/L5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞的凋亡率都極低;A549/DDP細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)為(1.41±0.10)%,10.0μmol/L5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)為(1.67±0.18)%,兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);也能證明10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h后不引起細(xì)胞凋亡。經(jīng)2.5、10.0和40.0μmol/L順鉑干預(yù)后,A549/DDP細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)分別為(3.57±0.94)%、(15.31±1.51)%和(34.89±1.81)%;5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)分別為(13.92±1.36)%、(25.44±1.91)%和(48.37±1.63)%,經(jīng)5-Aza-CdR干預(yù)后的細(xì)胞較單用順鉑的A549/DDP細(xì)胞凋亡程度明顯增高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。3hmlh1啟動(dòng)子甲基化全身化療是目前大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者的主要治療手段,而主要的含鉑類方案有效率只有30%~47%。由于耐藥的發(fā)生常導(dǎo)致肺癌化療的失敗。hMLH1基因是MMR系統(tǒng)的重要成分,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞hMLH1基因的甲基化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄之間呈負(fù)相關(guān)。去甲基化藥物5-Aza-CdR是一種常用的去甲基化藥物,研究者認(rèn)為低劑量持續(xù)給藥可能是以后研究的方向。低劑量的5-Aza-CdR雖無(wú)直接抗腫瘤作用,但能通過(guò)改變卵巢癌和結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞hMLH1甲基化狀態(tài),從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的順鉑耐受,所以低劑量的5-AzaCdR和化療聯(lián)合可能達(dá)到更好的臨床治療效果。hMLH1甲基化與化療耐藥研究主要集中在結(jié)直腸癌和卵巢癌。Strathdee等對(duì)卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株研究認(rèn)為hMLH1啟動(dòng)子甲基化可能是hMLH1表達(dá)喪失的常見(jiàn)機(jī)制,也可能是順鉑耐藥的機(jī)制。Plumb等研究卵巢癌及結(jié)腸癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤進(jìn)一步證實(shí)了hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是卵巢癌鉑類等細(xì)胞毒性藥物耐藥性的普遍機(jī)制。Watanabe等通過(guò)MS-PCR研究對(duì)首次和順鉑化療后二次切除的卵巢癌組織的hMLH1甲基化狀態(tài),認(rèn)為在卵巢上皮癌中hMLH1啟動(dòng)子甲基化是獲得性鉑類耐藥的重要分子學(xué)因素。Meyers等研究5-FU處理結(jié)腸癌細(xì)胞系后,hMLH1表達(dá)陰性的細(xì)胞較陽(yáng)性者對(duì)5-FU更具有耐受性。Arnold等發(fā)現(xiàn)用5-Aza-CdR可使細(xì)胞hMLH1基因表達(dá)增加,從而使原本對(duì)5-FU耐藥的細(xì)胞的敏感性增強(qiáng)。hMLH1啟動(dòng)子甲基化與NSCLC的病理生理密切相關(guān),大量研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中hMLH1蛋白及mRNA表達(dá)缺失與hMLH1基因甲基化有關(guān)。Kouso等研究表明hMLH1蛋白的低表達(dá)與遺傳的不穩(wěn)定性有關(guān)。鉑類藥物是NSCLC化療中的常用藥物,那么hMLH1甲基化是否也和NSCLC的鉑類耐藥有關(guān),是否也能通過(guò)逆轉(zhuǎn)hMLH1甲基化來(lái)改變NSCLC的鉑類耐藥狀態(tài),目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究。本研究選用耐順鉑的NSCLC細(xì)胞株A549DDP作為研究對(duì)象,并用其親本細(xì)胞株A549作為對(duì)照。發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞均表達(dá)hMLH1mRNA,但A549表達(dá)hMLH1mRNA明顯高于其耐藥株;且經(jīng)5-Aza-CdR作用后可上調(diào)A549/DDP的hMLH1mRNA表達(dá)。同時(shí)MSP結(jié)果可見(jiàn)經(jīng)5-Aza-CdR去甲基作用后可使A549/DDPhMLH1部分甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆癄顟B(tài),證明了hMLH1的甲基化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄之間呈負(fù)相關(guān)。在一定范圍內(nèi)隨5-Aza-CdR濃度的增加A549/DDP細(xì)胞中hMLH1mRNA的表達(dá)也增高。本研究發(fā)現(xiàn)10.0μmol/L5-Aza-CdR已經(jīng)能很好的逆轉(zhuǎn)hMLH1基因甲基化,恢復(fù)其基因表達(dá)。經(jīng)10.0μmol/L5-Aza-CdR干預(yù)后,A549/DDP對(duì)順鉑的IC50明顯下降,并且通過(guò)測(cè)量細(xì)胞凋亡形態(tài)及細(xì)胞凋亡率可進(jìn)一步證明,該濃度5-Aza-CdR明顯提高了A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性,發(fā)生了耐藥逆轉(zhuǎn)。由此說(shuō)明肺腺癌耐藥細(xì)胞株的發(fā)生與hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。但本研究也發(fā)現(xiàn),雖然5-AzaCdR干預(yù)細(xì)胞后,再用順鉑作用于A549/DDP,可顯著降低A549/DDP對(duì)順鉑的IC50,逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)約為4.34倍,但與親本細(xì)胞A549相比仍具有耐藥性,提示A549/DDP的化療耐藥還與其他耐藥相關(guān)基因有關(guān)。這一系列的耐藥相關(guān)基因可能從不同的作用位點(diǎn)以