-氨基丁酸對室旁核神經(jīng)元放電活動的影響

-氨基丁酸對室旁核神經(jīng)元放電活動的影響

干預腦癱室的中心在心血管活動的調節(jié)、活動引起的壓力、以及針灸和鎮(zhèn)痛方面發(fā)揮著重要作用。因此,研究神經(jīng)遞質、激素對室旁核神經(jīng)元的作用,對于闡明下丘腦在針刺鎮(zhèn)痛和應激等反應中的機理是很必要的。室旁核神經(jīng)分泌細胞接受多種神經(jīng)遞質的作用,其中去甲腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等已有文獻報道,但用電生理的手段研究GABA對離體下丘腦室旁核神經(jīng)元放電活動的影響及其機理還未見報道。本實驗采用腦薄片細胞外記錄技術,研究GABA對下丘腦室旁核神經(jīng)元放電活動的影響并探討其作用機理,為全面闡明下丘腦在神經(jīng)內分泌、針刺鎮(zhèn)痛和應激反應中的作用機理提供科學資料。1材料和方法1.1動物Sprague-Dawley大鼠,體重80～120g,雌雄不拘。1.2人工瞳片的制備將大鼠迅速斷頭,取出腦組織置于1～4℃的人工腦脊液中,根據(jù)解剖標志,切下含有下丘腦的組織塊,用對組織無損傷的快速粘合劑將組織塊粘于振動切片推進臺上,切片槽內倒入95%氧和5%二氧化碳飽和過的低溫人工腦脊液,沿組織塊的冠狀面切下厚約300～500μm的薄片。將腦薄片移至記錄浴槽小室的尼龍網(wǎng)上,浸沒在恒速灌流的人工腦脊液中。內槽溫度一般控制在30～35℃。1.3x-y儀掃描自適應放電神經(jīng)元下丘腦薄片經(jīng)過1～2h孵育后,用玻璃微電極作為細胞外記錄電極,在解剖顯微鏡下,根據(jù)組織學的標志,將微電極插到室旁核的區(qū)域,尋找自發(fā)放電神經(jīng)元,自發(fā)放電通過微電極放大器和直流前置放大器上可以觀察,同時輸入微機進行實時處理,然后在X-Y儀上描記放電頻率密度直方圖。每當記錄到某個具有自發(fā)放電活動的單位時,取3～5min的放電平均頻率做為對照,然后灌流藥物,如果放電頻率出現(xiàn)與給藥有關的明顯變化(頻率增加或減少30%以上)而且可以重復,則認為這種變化是藥物影響的結果。2結果2.1部位神經(jīng)元放電動力學所有實驗結果取自60個下丘腦腦薄片。在室旁核這一部位觀察了111個具有穩(wěn)定自發(fā)放電活動的神經(jīng)元,放電形式主要表現(xiàn)為不規(guī)則型(61.3%)、周期性放電型(27.9%)和快速連續(xù)型(10.8%)。2.2灌流濃度對gaba神經(jīng)元放電頻率的影響觀察了室旁核的98個神經(jīng)元GABA對放電的影響。首先觀察5～10min的放電活動作為對照,然后灌流濃度為10-3mol/L的GABA1.5～3min,其中有73個神經(jīng)元(74%)的放電頻率在給藥期間明顯減少,潛伏期短,呈明顯的量效關系,有3個神經(jīng)元(3%)的放電頻率增加,其余22個神經(jīng)元(23%)給藥期間放電頻率沒有明顯的改變(圖1)。2.3gaba反應的藥理學特性2.3.1激動器2.3.2抗baclofen反應GABAA受體的特異性的競爭性拮抗劑荷包牡丹堿(Bicuculline,10-10mol/L)能完全拮抗蠅蕈醇所引起的抑制反應,不能拮抗Baclofen的抑制反應(圖2)。荷包牡丹堿和印防己毒素本身所用濃度范圍對神經(jīng)元放電活動并無影響。2.4灌流低鈣高鎂的神經(jīng)元放電活動觀察為了觀察GABA對室旁核神經(jīng)元的直接作用及同一室旁核神經(jīng)元上是否同時存在GABAA和GABAB受體,在記錄到神經(jīng)元的自發(fā)放電活動穩(wěn)定了3～5min后,給腦片灌流低鈣高鎂的人工腦脊液6min,完全阻斷了突觸傳遞,這時記錄的是單個神經(jīng)元的放電活動,然后灌流GABA(10-3mol/L,2min)。觀察了20個在此條件下的神經(jīng)元的放電活動,其中15個(75%)表現(xiàn)為抑制,5個(25%)沒有反應。Bic可部分拮抗GABA(10-3ml/L)所引起的抑制反應,而且Baclofen(10-6mol/L)能產(chǎn)生明顯的抑制作用(圖3)。3討論3.1gaba通過局部的神經(jīng)環(huán)路本實驗的結果表明GABA對下丘腦室旁核74%神經(jīng)元放電活動具有抑制作用,潛伏期很短,藥物灌流到腦片就立即起抑制作用。值得注意的是,除抑制作用外,約有3%表現(xiàn)為興奮有效應,23%效應不明顯。GABA對PVN神經(jīng)元作用的多樣化,除了可能與受試細胞的類型有關外,不能排除GABA通過局部的神經(jīng)環(huán)路起作用的可能。在灌流低鈣高鎂液之后,阻斷突觸連接,觀察到的則是GABA對PVN神經(jīng)元的直接作用,在這種情況下,未見興奮效應的單位。3.2gabaa受體本實驗中還可觀察到,GABA對室旁核神經(jīng)元的抑制作用,除具有反應的特異性外,還具有明顯的濃度依賴性,受試神經(jīng)元的反應與灌流GABA的濃度具有明顯的量效關系。同時,GABA的抑制效應都可以被GABAA受體的特異性拮抗劑荷包牡丹堿和氯離子通道阻斷劑印防己毒素部分阻斷,這就提示PVN神經(jīng)元膜上有GABAA受體。另外,在同一神經(jīng)單位上,GABAA受體的特異性激動劑蠅蕈醇可以抑制PVN神經(jīng)元的放電活動,并可以完全被荷包牡丹堿所拮抗,而GABAB受體的激動劑苯氯丁氨酸也可產(chǎn)生明顯的抑制作用。上述結果提示GABA對室旁核放電抑制作用是通過GABAA和GAABB受體介導的。3.3gaba的抑制效應為避免局部神經(jīng)元回路對記錄單位的影響,并進一步證實在同一室旁核神經(jīng)元上是否同時有GABAA受體和GABAB受體,我們觀察了在低鈣高鎂液狀態(tài)下GABA的藥理學特性。腦片灌注了低鈣高鎂溶液6min后可以徹底阻斷突觸的傳遞,這時記錄到的放電是單個神經(jīng)元的放電活動,同時可以觀察到GABA的抑制效應可以被荷包牡丹堿所拮抗,在同一神經(jīng)元上,苯氯丁氨酸可產(chǎn)生明顯的抑制作用,這就證實了GABAA受體和GABAB受體共存于同一神經(jīng)元上,GABA的抑制效應是通過突觸后細胞膜上的GABAA和GABAB兩個受體共同介導的。本實驗證實,GABA對室旁核神經(jīng)元的放電具有明顯的抑制效應,且有明顯的量效關系,可被特異阻斷劑阻斷,所以此反應是由GABA受體介導的。下丘腦室旁核的同一神經(jīng)元的放電可被Muscimol\,Baclofen抑制,所以同一神經(jīng)元上同時存在GABAA受體和GABAB受體。GABA對加壓素神經(jīng)元的放電具有明顯的抑制效應,此反應由GAB