分子標(biāo)記優(yōu)化

分子標(biāo)記

MolecularMarkers2023/12/16園藝植物生物技術(shù)2Contents1、分子標(biāo)記的原理

DNA是主要的遺傳物質(zhì)

DNA的生物學(xué)特性

DNA檢測技術(shù)2、目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)SSR(simplesequencerepeat,微衛(wèi)星標(biāo)記)AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）3、分子標(biāo)記在園藝植物中的應(yīng)用2023/12/16園藝植物生物技術(shù)3標(biāo)記（Markers）遺傳標(biāo)記（Geneticmarkers)：是能明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。遺傳多態(tài)性(Geneticpolymorphisms)：經(jīng)典遺傳學(xué)中指等位基因的變異；現(xiàn)代遺傳學(xué)中指的是基因組中任何位點(diǎn)上的相對差異。Conceptions2023/12/16園藝植物生物技術(shù)41.形態(tài)標(biāo)記2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記3.生化標(biāo)記4.分子標(biāo)記TypesforGeneticmarkers2023/12/16園藝植物生物技術(shù)5概念：能明確反映遺傳多態(tài)性的外觀性狀，一般用肉眼可識別，或物理儀器便可識別的性狀。優(yōu)點(diǎn)：直觀、方便缺點(diǎn)：粗放，易變、數(shù)量有限Morphologicalmarker形態(tài)學(xué)上如何區(qū)分MorphologicalcharactersMorphologicalcharacters2023/12/16園藝植物生物技術(shù)8概念：能明確反映遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征，染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目是常見的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，它能反映染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目的遺傳多態(tài)性（染色體缺失、重復(fù)、倒位、易位）方法：染色體計(jì)數(shù)、染色體顯帶優(yōu)點(diǎn)：較形態(tài)學(xué)標(biāo)記穩(wěn)定，可靠缺點(diǎn)：過程復(fù)雜、對材料和儀器要求嚴(yán)格Cytologicalmarker2023/12/16園藝植物生物技術(shù)9種類：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)的生理性質(zhì)不同的一類酶蛋白質(zhì)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小。蛋白質(zhì)標(biāo)記的缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)受生物體發(fā)育的時空影響很大Biochemical(Protein)Marker2023/12/16園藝植物生物技術(shù)10DNAmarker概念：一切能揭示DNA多態(tài)性的技術(shù)手段；它是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映，也就是通常人們所說的分子標(biāo)記。分類： 1.基于DNA-DNA雜交的標(biāo)記 2.基于PCR的DNA標(biāo)記 3.PCR與雜交相結(jié)合的標(biāo)記 4.SNP2023/12/16園藝植物生物技術(shù)11核酸水解單核苷酸磷酸基團(tuán)核苷戊糖脫氧核酸（DNA）核酸（RNA）堿基TACGUDNARNAChemicalComponentofDNA&RNA2023/12/16園藝植物生物技術(shù)12TheStructureofDNA2023/12/16園藝植物生物技術(shù)13DoublehelixstructureofDNA5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸核糖堿基T-A堿基對C-G堿基對2023/12/16園藝植物生物技術(shù)14BiologicalCharactersofDNA

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)15MethodsforDNAExtraction方法：SDS法和CTAB法。原理：在去污劑和適當(dāng)溫度條件下使細(xì)胞充分裂解，并抑制DNA酶活性；經(jīng)氯仿、苯酚等處理使蛋白質(zhì)變性，離心后除去。溶液中的DNA經(jīng)酒精或異丙醇沉淀。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)16AgaroseGelElectrophoresis

DNA分子帶負(fù)電，從瓊脂糖凝膠的負(fù)極向正極泳動，速度依賴于其分子質(zhì)量——小的緊密的DNA分子的較大伸展片斷容易穿過瓊脂糖介質(zhì)。試劑：電泳緩沖液（TAE或TBE）；電泳瓊指糖；EB或SYBRGreen；指示劑（加樣緩沖液）儀器：電泳儀（直流電）；電泳槽

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)17

FluorescenceStainingofDNAEB、SYBRGreen、DAPE等2023/12/16園藝植物生物技術(shù)18

FluorescenceStainingofDNA2023/12/16園藝植物生物技術(shù)19

IsotopeLabeling

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)20ApparatusforDNAAssaying2023/12/16園藝植物生物技術(shù)21GelElectrophoresisPCR的發(fā)明，應(yīng)用現(xiàn)狀

及未來發(fā)展趨勢2023/12/16園藝植物生物技術(shù)23PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）全稱：PolymerphaseChainReaction基本原理：是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制2023/12/16園藝植物生物技術(shù)24DNA，

生命的藍(lán)圖故事發(fā)生在1983年

的春夏之交2023/12/16園藝植物生物技術(shù)26KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。

他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，

卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一2023/12/16園藝植物生物技術(shù)27Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……2023/12/16園藝植物生物技術(shù)28Mullis的第一個PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。

Mullis在反應(yīng)體系中加

入DNA聚合酶后在37

℃一直保溫。結(jié)果第二

天在瓊脂糖電泳上沒有

看到任何條帶。于是他認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)29PCR的發(fā)展史1983年春，Mullis發(fā)展出PCR（polymerasechainreaction）的概念；1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個循環(huán)；1983年12月，用同位素標(biāo)記法看到了10個循環(huán)后的49bp長度的第一個PCR片斷；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒；1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號4,683,202

），這回Mullis是第一發(fā)明人。1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法；1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，這是85年春天Mullis建議做的；1988年，第一臺PCR儀問世；1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)302023/12/16園藝植物生物技術(shù)31PCR不只是一個方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。PCR的應(yīng)用領(lǐng)域2023/12/16園藝植物生物技術(shù)33生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）

/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）2023/12/16園藝植物生物技術(shù)34PCR儀器的變遷三個水浴鍋，

用手移動

（Mullis等人當(dāng)時用的）電加熱塊

＋

自來水冷卻

（PE，1988）電加熱塊

＋

內(nèi)置循環(huán)液冷卻

（PE，1989）三個加熱塊

＋

機(jī)械手

（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱

（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測

(如Roche的Lightcycler)Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）2023/12/16園藝植物生物技術(shù)35PCR相關(guān)的術(shù)語和產(chǎn)品層出不窮T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan/SYBRgreen2023/12/16園藝植物生物技術(shù)36

PCR動畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過

程變

性引

物

退

火DNA復(fù)制2023/12/16園藝植物生物技術(shù)37

類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。PrincipleforPCR2023/12/16園藝植物生物技術(shù)3812345557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍

PrincipleforPCR2023/12/16園藝植物生物技術(shù)39

PCRReactionSystem10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul2023/12/16園藝植物生物技術(shù)40ImperativeelementsinPCRReaction引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）2023/12/16園藝植物生物技術(shù)41Primer引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)42TaqDNA聚合酶

TaqDNAPolymerphaseTaqDNA聚合酶是從Thermusaquaticus菌提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94kDa。這種酶的天然形式可在74℃復(fù)制DNA，在95℃的半衰期為40分鐘。TaqDNA聚合酶在鎂存在的條件下可催化核苷酸沿5'-3'方向發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA；同時它還具有5'-3'外切酶活性。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)43離子需要：對Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較敏感。最適濃度為50mmol/L。忠實(shí)性:沒有校正單核苷酸錯配功能--致命弱點(diǎn)。一般出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意。TaqDNAPolymerphase2023/12/16園藝植物生物技術(shù)44Template（targetgene）模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。對模板DNA質(zhì)量的要求因標(biāo)記的種類不同而有所差異，一般說來基于RFLP（酶切）的標(biāo)記對DNA質(zhì)量要求很高，而PCR標(biāo)記對模板DNA質(zhì)量要求并不很高，主要防止Taq酶抑制劑污染。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)45

ConcentrationofMg2+Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)46PCR常見問題、原因分析及其解決方案提高PCR反應(yīng)特異性的策略PCR技術(shù)簡介2023/12/16園藝植物生物技術(shù)47PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板

引物

反應(yīng)緩沖液dNTPddH2O

耐熱聚合酶2023/12/16園藝植物生物技術(shù)48反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響DNA模板純度

蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度

加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加特異性

長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性

避免反復(fù)凍融濃度

應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則引

物擴(kuò)增產(chǎn)物太少2023/12/16園藝植物生物技術(shù)49反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響反應(yīng)Buffer

pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強(qiáng)劑Mg2＋濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)避免污染2023/12/16園藝植物生物技術(shù)50PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板

引物

反應(yīng)緩沖液Mg2＋dNTPddH2O

耐熱聚合酶2023/12/16園藝植物生物技術(shù)51如何選擇最合適的DNA聚合酶

DNA聚合酶的特性

PCR

實(shí)驗(yàn)的不同需求2023/12/16園藝植物生物技術(shù)52如何選擇最合適的DNA聚合酶

－－

DNA聚合酶的特性純

度穩(wěn)定性酶活性2023/12/16園藝植物生物技術(shù)53如何選擇最合適的DNA聚合酶

－－

PCR

實(shí)驗(yàn)的不同需求長片段擴(kuò)增PCR試劑盒

擴(kuò)增效率

保

真

性

特

異

性

基因組擴(kuò)增、RT-PCR

基因篩選、測序、

基因克隆

復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級結(jié)構(gòu)）構(gòu)建基因圖譜、測序、分子遺傳學(xué)

復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測2023/12/16園藝植物生物技術(shù)54特異性－

熱啟動Taq酶原

理

蠟封

抗體抑制

化學(xué)修飾特

點(diǎn)

避免非特異性擴(kuò)增

提高PCR反應(yīng)的特異性用

途

基因組擴(kuò)增

RT-PCR2023/12/16園藝植物生物技術(shù)55－

熱啟動Taq酶特異性產(chǎn)

品

類

型產(chǎn)

品

名

稱產(chǎn)

品

性

能化學(xué)修飾

天為時代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:Thermo-start?DNAPolymeraseStratagene:SureStart?Taq大大提高PCR反應(yīng)的特異性

化學(xué)修飾不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)抗體抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum?

TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蠟封Promega：TaqBeadTM

HotStart2023/12/16園藝植物生物技術(shù)56保真性—高保真酶原

理用

途

3’－5’核酸

表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變

細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）

外切酶活性

降低堿基錯配率

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)57

高保真

＋

高擴(kuò)增效率原

理

混合酶－高擴(kuò)增效率－3’－5’核酸外切用

途

超長片段擴(kuò)增

－測序

－構(gòu)建基因圖譜

復(fù)雜模板擴(kuò)增－GC含量高－二級結(jié)構(gòu)2023/12/16園藝植物生物技術(shù)58PCR

MasterMix原

理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液DNA聚合酶

反應(yīng)緩沖液dNTPPCR增強(qiáng)劑

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)59PCR

MasterMix特

點(diǎn)

快速簡便

減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴(kuò)增低至2個拷貝的目的模板

特異性強(qiáng)

降低PCR反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性

穩(wěn)定性好

長期放置活性無改變適用范圍

大規(guī)?；驒z測

目的基因拷貝數(shù)極低的樣本

GC含量高,有二級結(jié)構(gòu)的模板

復(fù)雜基因組樣本

可直接檢測菌落，基因點(diǎn)突變檢測,

或者陽性克隆的篩選。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)60PCR常見問題

無擴(kuò)增產(chǎn)物

非特異性擴(kuò)增

拖尾

假陽性2023/12/16園藝植物生物技術(shù)61PCR常見問題之一無擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；2023/12/16園藝植物生物技術(shù)62PCR常見問題之二

非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)63PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴(kuò)增2023/12/16園藝植物生物技術(shù)64PCR常見問題之三

拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。

M122023/12/16園藝植物生物技術(shù)65PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾2023/12/16園藝植物生物技術(shù)66PCR常見問題之四

假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)67巢式PCR（Nest-PCR）四種策略

遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動PCR（HotStartPCR）

使用PCR增強(qiáng)劑2023/12/16園藝植物生物技術(shù)68策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)69策略之二遞減PCR（TouchDownPCR）

遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。

特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢。

遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)70策略之三熱啟動PCR（HotStartPCR）

熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR

儀達(dá)到變性溫度；

現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用；

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)71策略之四使用PCR增強(qiáng)劑

甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。

其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。

增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)

從定性到定量的革命2023/12/16園藝植物生物技術(shù)73PCR產(chǎn)物生成曲線log[DNA]Cycles2023/12/16園藝植物生物技術(shù)74PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時2023/12/16園藝植物生物技術(shù)75PCR具有極高的靈敏度樣品正對照負(fù)對照標(biāo)準(zhǔn)分子量

污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增過某個片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。因此，做實(shí)驗(yàn)的時候絕對不要忘了負(fù)對照。用紫外燈破壞污染物也是一個辦法2023/12/16園藝植物生物技術(shù)76log[DNA]Cycles不同樣品有不同的生成曲線2023/12/16園藝植物生物技術(shù)77普通PCR和定量PCR的區(qū)別適用定性分析，不適合定量分析；PCR產(chǎn)物的長度從100bp－數(shù)kb實(shí)時檢測:每個循環(huán)都產(chǎn)出熒光信號絕對定量，靈敏度更高

PCR產(chǎn)物的長度一般在60-150bps2023/12/16園藝植物生物技術(shù)78定量PCR相關(guān)的近年來

國際學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表的論文數(shù)199619971998199920002003年已經(jīng)達(dá)到3000篇2023/12/16園藝植物生物技術(shù)79Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一個專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申請2023/12/16園藝植物生物技術(shù)80SYBRgreen的優(yōu)缺點(diǎn)簡便可以使用已有的引物普遍通用可以檢測所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體；需要化大力氣優(yōu)化反應(yīng)條件，以消除非特異性擴(kuò)增；價格

$1/PCR反應(yīng)定量的靈敏度有所欠缺2023/12/16園藝植物生物技術(shù)81定量PCR，TaqMan體系A(chǔ)BI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,

1995年11月申請。實(shí)時檢測:

每個循環(huán)都會產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì)2023/12/16園藝植物生物技術(shù)82TaqMan系統(tǒng)的一個例子10ng0.001ngTitrateatemplate;10,1,0.1,0.01,0.001ng2023/12/16園藝植物生物技術(shù)83Taqman的優(yōu)缺點(diǎn)

單一熒光系統(tǒng)中

不能在同一管中進(jìn)行多片斷擴(kuò)增

不同的基因必須在不同的試管中管之間的精確度跟多熒光系統(tǒng)同等的精確和

可靠靈敏度高，定量方便費(fèi)用高多種熒光提供儀器價格比較貴PCR會用于基因身份證的制作嗎？2023/12/16園藝植物生物技術(shù)85

到2030年，預(yù)計(jì)只要1000美金就能得到個人的基因組序列。人與人之間平均1000個堿基對就有一個堿基呈多態(tài)性(SNP)。因此共有300萬堿基上可能存在差異,而真正有價值的SNP也許只有1－2萬個。

防治基因信息的濫用和基因歧視，將是今后社會的重任。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)86現(xiàn)有數(shù)十種分子標(biāo)記技術(shù)，萬變不離其宗：

分子雜交、PCR擴(kuò)增、序列分析。第一類：分子雜交為核心代表：RFLP、DNA指紋第二類：PCR為核心代表：RAPD、SSR、AFLP第三類：DNA序列為核心代表：ITS測序分析IntroductionofMolecularmarkers2023/12/16園藝植物生物技術(shù)87TypesofDNAMarkersRFLP-restrictionfragmentlengthpolymorphism(pm)（限制性片段長度多態(tài)性）VNTR-variablenumbertandemrepeat（變化數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)）RAPD-randomamplificationofpolymorphicDNA（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）AFLP-amplifiedfragmentlengthpm（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）SSR-simplesequencerepeat（簡單序列重復(fù)）2023/12/16園藝植物生物技術(shù)88AdvantagesofDNAMarkers數(shù)量豐富、信息量大；與生長發(fā)育無關(guān)，取材不受限制；較多共顯性，信息量完整在真核生物中，基因組DNA多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于各種基因的遺傳多態(tài)性，因?yàn)榛蚪M中存在著大量的不編碼的DNA序列，它們的變異不受或較少地受自然選擇的制約2023/12/16園藝植物生物技術(shù)89ApplicationsofDNAMarkers種質(zhì)資源研究品種純度鑒定（包括DNA指紋鑒定）構(gòu)建遺傳連鎖圖基因定位（QTL）標(biāo)記輔助選擇比較基因組研究基因克?。▓D位克隆）生物起源、進(jìn)化、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)2023/12/16園藝植物生物技術(shù)90全稱：

RestrictionFragmentLengthPolymorphism

(byBotstein,1980)基本原理：物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，把與被標(biāo)記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）2023/12/16園藝植物生物技術(shù)91優(yōu)點(diǎn)：共顯性，非常穩(wěn)定，是目前公認(rèn)的最可靠的標(biāo)記方法缺點(diǎn)：DNA純度要求高、用量大；檢測步驟多、周期長；費(fèi)時、費(fèi)錢；用作探針的DNA克隆制備、保存不方便；同位素有放射性自從人的RFLP圖譜構(gòu)建后，在番茄中構(gòu)建了第一張植物的圖譜，現(xiàn)在仍然廣泛應(yīng)用RFLP2023/12/16園藝植物生物技術(shù)92

PrincipleforRFLPsSameprincipleforDNA/DNA,DNA/RNA,orRNA/RNA2023/12/16園藝植物生物技術(shù)93PrincipleforRFLPs2023/12/16園藝植物生物技術(shù)94高質(zhì)量DNA提取DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜、固定探針制備、標(biāo)記預(yù)雜交、雜交洗膜、壓片、顯影膜再生

ProceduresforRFLPs2023/12/16園藝植物生物技術(shù)95DNAMarkers

MostwidelyusedmarkersCanbehybridizationorPCR-basedTimerange-2hoursto1weekCandetectsinglenucleotidedifferenceSNP-singlenucleotidepolymorphorism2023/12/16園藝植物生物技術(shù)96HybridizationbasedMarker-RFLP性質(zhì)：RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism)是DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記。原理:這種多態(tài)性是由于限制性酶切位點(diǎn)或位點(diǎn)附近的DNA區(qū)域發(fā)生變異所引起的。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)97RFLP多態(tài)性的類型

TypeofPMinRFLPMarkers

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)99ProcessesforRFLP

Manipulation1.高質(zhì)量DNA的提取液氮研磨加入提取緩沖液溫浴氯仿處理離心（上清液）酒精TE溶解質(zhì)量檢測（或純化）提取DNA的兩個條件：抑制DNA酶活性；加入去污劑破碎細(xì)胞。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)1002.限制性酶切：

取10—15微克DNA，加入約5U于最適溫度下保溫12—18小時。ProcessesforRFLPManipulation2023/12/16園藝植物生物技術(shù)1013.轉(zhuǎn)膜4.探針標(biāo)記5.雜交6.洗膜7.放射自顯影RFLP的操作

ProcessesforRFLPManipulation2023/12/16園藝植物生物技術(shù)102ExamplesofRFLPAnalysis

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)103ByChengetal,2003.(PublishedinPMBR)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘課題組ExamplesofRFLPAnalysisinCitrus2023/12/16園藝植物生物技術(shù)104

PCRBasedMarker—RAPDWilliams

等人于1990年首創(chuàng)的一種DNA技術(shù)，被稱為RandomamplificationofPolymorphicDNA(隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）。2023/12/16園藝植物生物技術(shù)105原理：以PCR為基礎(chǔ),利用人工合成的約10b的隨機(jī)序列寡核苷酸作引物,以生物的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物,通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列的多態(tài)性。RAPD反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)可多達(dá)40—50次,每次循環(huán)中,雙鏈DNA在95℃的高溫下變性,解開雙螺旋成為單鏈模板,然后在低溫(36℃)條件下與隨機(jī)引物結(jié)合,在DNA多聚酶的作用下，按堿基互補(bǔ)原則沿5‘至3’的方向把核苷酸鏈延長，完成DNA復(fù)制。如此反復(fù)數(shù)十次,可以使單一的DNA序列擴(kuò)增105-107倍。PrincipleofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)106PrincipleofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)107PrincipleofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)108RAPD的實(shí)驗(yàn)操作

ManipulationofRAPD一、

材料

不同來源的DNA(50ng/ul)。二、設(shè)備

PCR儀，PCR管或硅化的0.2mleppendorf管，電泳裝置。三、試劑

1、隨機(jī)引物(10mer)(5umol/L)。

2、Taq酶：購買成品。

3、10xPCR緩沖液。

4、MgCl2

：25mmol/L。

5、dNTP：每種2.5mmol/L2023/12/16園藝植物生物技術(shù)109四、反應(yīng)體系：在25ul反應(yīng)體系中加入：至25ul加ddH2O混勻稍離心,加一滴礦物油1單位（U）Taq酶2uldNTP2ulMgCl22.5ul10xPCRBuffer1ul(約5pmol)隨機(jī)引物1ul(50ng)模板DNA體積（濃度）成分RAPD的實(shí)驗(yàn)操作

ManipulationofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)110五、擴(kuò)增程序在PCR儀中預(yù)變性94℃3分鐘；然后循環(huán):94℃1分鐘，36℃1分鐘，72℃1分鐘，共40輪循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后,72℃10分鐘，4℃保存。六、電泳取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液于1.5%瓊脂糖膠上電泳,穩(wěn)壓50-100Ｖ，2—3小時。七、結(jié)果觀察與記錄一般RAPD帶有5-15條,大小0.1-2.0kbRAPD的實(shí)驗(yàn)操作

ManipulationofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)111RAPD標(biāo)記的特征

CharacteristicsofRAPD

①引物很短（10base）②只有1種引物參與反應(yīng)③引物在染色體上隨機(jī)結(jié)合④退火溫度低一般為35-37℃⑤當(dāng)兩引物在互補(bǔ)的模板DNA鏈上的結(jié)合位點(diǎn)距離小于2000bp便可擴(kuò)增出該區(qū)域2023/12/16園藝植物生物技術(shù)112優(yōu)點(diǎn)：--實(shí)驗(yàn)步驟少，省工、省力、進(jìn)度快；--不需先知道基因組的任何分子信息；--所用材料不需有性世代，可用任何單一親本；--引物具有廣泛性和通用性。缺點(diǎn):

RAPD是一種顯性標(biāo)記,不能區(qū)分純合子與雜合子；易受實(shí)驗(yàn)條件的影響,表現(xiàn)為擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性差。RAPD標(biāo)記的優(yōu)、缺點(diǎn)

Advantages&DisadvantagesofRAPD2023/12/16園藝植物生物技術(shù)113SSR:SimpleSequenceRepeat，簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite）或短的串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeat,STR)。MicrosatelliteDNA：一類由幾個核苷酸（一般1-5個，基序很短）為重復(fù)單位串聯(lián)而成的DNA序列。微衛(wèi)星DNA廣泛存在于真核生物中，人和動物（TG）n，植物（AT)n微衛(wèi)星DNA長度的多態(tài)性;微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列?；赑CR的標(biāo)記—SSR

PCRBasedMarker—SSR

2023/12/16園藝植物生物技術(shù)114微衛(wèi)星的類型

TypesofMicrosatellites1、MononucleotideSSR(A)11 AAAAAAAAAAA2、 DinucleotideSSR(GT)6 GTGTGTGTGTGT3、 TrinucleotideSSR(CTG)4 CTGCTGCTGCTG4、 TetranucleotideSSR(ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC2023/12/16園藝植物生物技術(shù)115Homozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…

5’flankingregion microsatellitelocus 3’flankingregionHeterozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…微衛(wèi)星的類型

TypesofMicrosatellites2023/12/16園藝植物生物技術(shù)116

根據(jù)兩端序列的保守性設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，電泳分離，染色顯帶以檢測微衛(wèi)星序列多態(tài)性。SSR標(biāo)記的原理

PrincipleofSSR

多態(tài)性好、重復(fù)好、共顯性標(biāo)記2023/12/16園藝植物生物技術(shù)117SSR在染色體中的分布

WhereAreMicrosatellitesFound?Majorityarelocatedinnon-codingregion2023/12/16園藝植物生物技術(shù)118SSR標(biāo)記的開發(fā)

StrategiesforSSRmarkerDevelopment1.基于DNA文庫方法20